香菇（Lentinus edodes）属于真菌门担子菌亚门伞菌目口蘑科香菇属[1]，在食用菌种植上是全球第二大品种[2]。肉质肥厚细嫩、香气浓郁、营养丰富而广受人们喜爱，是一种药食同源的食物，具有抗氧化、预防种瘤、增强机体免疫力、降血脂、抗血栓、健脾保肝、预防佝偻病及贫血等功效，是我国久负盛名的食用菌[3]。但在日常生活和加工生产过程中，常将香菇柄丢弃，造成资源上的巨大浪费。香菇柄约占香菇总质量的25%～30%，因其含有大量的膳食纤维，直接食用不仅难以咀嚼，并且不利于消化吸收，但将香菇柄进行发酵后制作成酱糕，不仅保留了营养成分还赋予了其特殊的风味物质[10-11]。
香菇柄发酵酱糕是以黄豆、糯米、香菇柄粉为原料制成的香菇酱，经过添加其他的食品原料制成的一种糕点，不但营养丰富而且风味独特，含有蛋白质、多肽、维生素等对人体有益的生理活性物质，具有一定的保健功能。
本试验以糯米、黄豆为原料，米曲霉为发酵菌种进行香菇柄发酵酱糕的制曲，以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纤维素酶活力为评价指标[12]，通过单因素试验和响应面优化试验挑选出制曲的最优条件，旨在为生产品质优异的香菇柄发酵酱糕提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄豆：赣州康瑞农产品有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：济宁玉园生物科技有限公司；糯米：市售；可溶性淀粉：西陇化工股份有限公司；福林酚、干酪素、3,5二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂：北京索莱宝科技有限公司；羧甲基纤维素钠：上海展云化工有限公司。
1.2 仪器与设备
MHP-250型霉菌培养箱：上海三发科学仪器有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器、LDZM立式压力蒸汽灭菌器、GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；JH2102电子天平：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 制曲工艺
黄豆与糯米按照一定的比例混合，浸泡12 h后捞出沥干水分，在121 ℃高压灭菌锅中灭菌15 min，取出后摊开放置于桌面自然冷却至30 ℃以下，接种一定比例的米曲霉As3.042，随后放入霉菌培养箱中恒温培养至制曲结束，在此期间翻曲1次，防止米曲霉As3.042在曲料上生长不均匀影响成曲品质。
1.3.2 单因素试验
设定糯米黄豆质量比分别为1∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4，米曲霉接种量分别为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%[13]，培养时间分别为12h、24h、36h、48h、60h，培养温度分别为22℃、26℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃。原料混匀后浸泡12 h捞出沥干水分，在121 ℃高压灭菌锅中蒸煮15 min，取出冷却至30 ℃以下，接入0.7%的米曲霉As3.042，霉菌培养箱中30 ℃培养48 h后取出，在40 ℃的烘箱内烘干后粉碎测定酶活力，分别考察原料质量比、接种量、培养时间及培养温度对制曲的影响。
1.3.3 响应面优化试验设计
根据单因素试验选出的条件，对米曲霉接种量、培养时间、培养温度3个因素，每个因素设置3个水平，利用Design-Expert8.0.6软件进行响应面优化试验，并对所得试验数据进行方差分析，确定最佳制曲工艺条件，试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization
1.3.4 试验指标的测定
蛋白酶活力测定参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定》福林酚法相关步骤，只进行了中性蛋白酶酶活的测定[14]；水分含量的测定按照国标GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中常压干燥法测定[15]；淀粉酶活力测定采用DNS比色法进行测定[16]；纤维素酶活力的测定采用羧甲基纤维素钠法[17]。
1.3.5 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和优化分析、SPSS 26.0进行试验数据的统计与分析、Origin 8.5进行绘图处理。所有试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 制曲工艺优化单因素试验
2.1.1 原料质量比对成曲酶活力的影响
由图1可知，当糯米与黄豆的质量比为2∶3时，成曲中蛋白酶活力达到峰值为2 535.05 U/g，此时淀粉酶活力与纤维素酶活力已经由峰值开始减小，但因这两种酶对产品的品质影响较小。因此，选用糯米与黄豆的质量比为2∶3时制曲。
图1 不同原料质量比对酶活力的影响
Fig.1 Effect of different material mass ratios on enzyme activities
2.1.2 接种量对成曲酶活力的影响
由图2可知，随着米曲霉接种量的不断增加，三种酶活力均呈现先增大后减小的趋势。接种量为0.5%时，纤维素酶活力达到最大值为67.35 U/g，此时蛋白酶活力、淀粉酶活力还未达到峰值；当接种量为0.7%时，蛋白酶活力、淀粉酶活力最大为2 536.46 U/g和245.13 U/g。随着接种量的继续增加，酶活力都出现降低的趋势，这是由于接种量过大时，米曲霉所需要的营养物质不能满足自身的生长需要，进而影响后续的酶活力大小。因此，在进行响应面试验时选取米曲霉接种量为0.5%、0.7%、1.0%。
图2 不同米曲霉接种量对酶活力的影响
Fig.2 Effect of different inoculum of Aspergillus oryzae on enzyme activity
2.1.3 培养时间对成曲酶活力的影响
由图3可知，培养时间在12～60 h之间时，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活力都随培养时间的延长呈现出先增大后减小的规律，3种酶活都在培养时间在48 h达到峰值。当生长条件适宜的情况下，米曲霉生长旺盛，三种酶活力增强，随着培养时间的延长，原料中的各种营养物质被消耗，菌丝体因缺乏营养物质逐渐开始衰退，代谢产物减少，三种酶活力达到最大值后便开始有所下降。因此，选用44 h、48 h、52 h设计响应面试验。
图3 不同培养时间对酶活力的影响
Fig.3 Effect of different culture time on enzyme activity
2.1.4 培养温度对成曲酶活力的影响
当培养箱的温度设置的过低时，酶虽然不会失活，但温度对酶的钝化作用使米曲霉的生长与新陈代谢活动减弱，从而酶活力变弱。过高的温度对米曲霉生长与产酶的影响更大，甚至会直接导致酶的失活[18]。由图4可知，培养温度在26～34 ℃区间时，三种酶活力都出现先增大后减小的趋势，在温度为30 ℃时三种酶活力均达到最大值分别为2 365.10 U/g、403.51 U/g、46.25 U/g。因此，选择26 ℃、30 ℃、34 ℃用于后续的响应面试验。
图4 不同培养温度对酶活力的影响
Fig.4 Effect of different culture temperature on enzyme activity
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
根据响应面Box-Behnben试验的原理，固定糯米与黄豆质量比为2∶3，选取米曲霉接种量（A）、培养时间（B）、培养温度（C）为试验因素，以蛋白酶活力（Y）为响应值进行响应面试验设计，设计方案及结果见表2。
由于米曲霉接种量、培养时间、培养温度对蛋白酶活的影响不是简单的线性关系，因此对试验所得数据进行了多元回归分析，明确了米曲霉接种量（A）、培养时间（B）、培养温度（C）三个因素对响应值蛋白酶活力（Y）的影响情况，分析后得到的回归方程为：
表2 发酵条件优化响应面试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization
2.2.2 模型方差分析
通过软件Design-Expert 8.0.6对试验结果进行方差分析，以验证回归模型与因素的显著性，方差分析结果见表3。由表3可知，二次多项式回归模型P＜0.000 1，决定系数R2=98.89%＞85%，说明该回归模型极显著、拟合程度很好，试验误差小，可用该回归方程代替试验真实点对香菇柄发酵酱糕的制曲试验结果进行分析和预测。失拟项P=0.1108＞0.05，说明失拟项不显著。根据F值可知，3个因素对成曲蛋白酶活力的影响大小从大到小依次为：培养温度（C）、米曲霉接种量（A）、培养时间（B）。一次项A对结果影响显著（P＜0.05），一次项C对结果影响极显著（P＜0.01）。交互项AB、AC、BC对酶活的影响均不显著（P＞0.05），但二次项A2、B2、C2对酶活的影响极显著（P＜0.01）。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis of regression equation
注：P＜0.01表示因素对响应值的影响极显著；P＜0.05表示因素对响应值的影响显著。
2.2.3 响应面分析
米曲霉接种量、培养时间、培养温度的交互效应及等高线见图5。响应面越陡则说明该试验中的某个因素对蛋白酶活力的影响越大，等高线越近似于一个椭圆形，那么就表示这两个因素的交互作用越强[19]。由图5a可知，随着米曲霉接种量和培养时间的增加，蛋白酶活力呈现先增大后减小的趋势，且其等高线图偏圆形，判断米曲霉接种量和培养时间之间的交互作用不显著；由图5b可知，随着米曲霉接种量和培养温度的提高，蛋白酶活力呈现先增加后减小的趋势，等高线图呈椭圆形，说明米曲霉接种量和培养温度之间存在一定的相互影响作用，但它们的交互作用不显著；由图5c可知，等高线偏椭圆形，表明两个因素之间有一定的交互作用但不显著，这与回归方程方差分析的结果是一致的[20]。对响应面试验模型进一步分析筛选，计算得到香菇柄发酵酱糕的最优制曲工艺条件为米曲霉接种量0.78%、培养时间48.02 h、培养温度30.85 ℃，此条件下蛋白酶活力预测值为2 592.67 U/g。
图5 各因素交互作用对蛋白酶活力影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of each factor on protease activity
2.2.4 验证试验
根据试验所需条件和实际的可操作性，调整修正后的香菇柄发酵酱糕制曲条件为：米曲霉接种量0.8%、培养时间48 h、培养温度30 ℃。在此条件下进行3次重复性验证试验，对制曲试验结果取平均值，得到香菇柄发酵酱糕成曲的蛋白酶活力实际值为2 625.48 U/g，同模型预测值的相对误差仅为1.27%（＜5%），说明响应面法对香菇柄发酵酱糕制曲的工艺条件优化具有实际可行性，可为后续实际生产应用提供一定的理论基础[21]。
3 结论
本试验首先依据蛋白酶活力、淀粉酶活力、纤维素酶活力的大小，采用单因素试验确定了各个因素的最优范围，然后采用响应面试验对制曲的条件进行优化，以获得品质符合要求的成曲。优化后得到香菇柄发酵酱糕的最佳制曲工艺为：在糯米和黄豆质量比2∶3、米曲霉接种量0.8%、培养时间48 h、培养温度30 ℃，所得到的成曲蛋白酶活力为2 625.48 U/g，该成曲表面布满黄绿色孢子，菌丝体生长良好，有明显的曲香味，无杂菌生长和其他异味。
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