水果具有生产上市时间较为集中，货架期短、不耐贮存的特点，极易出现旺季滞销的问题[1]。果醋属于水果精深加工产品[2]，选择适宜品种进行果醋加工是解决水果滞销的一个有效途径。果醋既具有传统醋的酸味物质，又具有水果的果香味和营养成分，被誉为第四代饮料[3]。传统的果醋发酵主要分为两个阶段，第一个阶段是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将水果汁中的糖分发酵成酒精，第二个阶段是利用醋酸菌将酒精转化成醋酸。采用这种发酵方式生产的果醋存在酸味单一、口感刺激的问题。添加乳酸菌发酵是改善果醋风味的一个途径，果醋中不挥发酸的主要成分是乳酸，乳酸与其他成分一起能赋予果醋圆润和棉柔的风味[4]。醋醅中有丰富的乳酸菌菌种资源，高产酸乳酸菌在食醋酿造过程中具有一定的应用价值。许女等[5]从山西老陈醋发酵过程中分离筛选得到1株高产酸、高产乙偶姻的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和1株发酵挥发性成分含量丰富的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），并将其应用于山西老陈醋发酵，大幅度提升了山西老陈醋总酸、不挥发性酸和总酯的含量；余永建[6]从镇江香醋醋醅中分离得到一株瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），并将其应用于食醋强化发酵，能有效缩短醋酸发酵周期、提高乳酸相对含量、改善食醋口感。然而目前关于从果醋醋醅分离高产酸乳酸菌的研究鲜见报道。
本研究采用MRS培养基从桃果醋醋醅中分离具有强产酸能力的乳酸菌，通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定，并研究其乙醇耐受能力、产酸能力和抗生素敏感性，从而筛选出具有改善果醋风味品质的乳酸菌菌株。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桃果醋醋醅：大竹鹏程果业农民专业合作社；MRS肉汤培养基、MRS固体培养基：北京奥博星生物技术有限公司；乙醇（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、琼脂粉（生化试剂）：成都市科龙化工试剂厂；DL-苹果酸、D-酒石酸、琥珀酸、富马酸、草酸、柠檬酸、乙酸、L-乳酸、奎宁酸标准品：美国Sigma公司；抗生素纸片：杭州微生物试剂有限公司；土壤基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提试剂盒、2×Taq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）、引物1492R（5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司；BHI乳酸菌生化鉴定条：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
HPX-87H液相分析柱：美国伯乐公司；AC2-6S1二级生物安全柜：新加坡Esco公司；CP153分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技公司；FlexCycle PCR仪：德国耶拿分析仪器有限公司；SUP-250生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HBM-400拍击式均质器：天津恒奥科技发展有限公司；5810R台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Synergy HTX多功能微孔板检测仪：美国伯腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳酸菌菌株的分离纯化
称取10 g桃果醋醋醅到100 mL无菌生理盐水中，用拍击式均质器拍打混匀，取1 mL均质液到9 mL无菌生理盐水进行梯度稀释，取10-6、10-7、10-8倍稀释液100 μL到含1%CaCO3的MRS固体平板，涂布，37 ℃培养48 h，挑取具有最大溶钙圈的菌落接种到含1%CaCO3的MRS固体平板反复划线纯化获得纯菌株。
1.3.2 分离菌株的鉴定
形态观察：将分离菌株接种到MRS固体平板上，37 ℃培养48 h，观察菌落形态和显微形态。
生理生化试验：将分离菌株划线接种到MRS固体平板上，37 ℃培养24 h长出单菌落，随机挑取2个平板上的单菌落分别用生理盐水制成菌悬液，根据说明书接种到BHI乳酸菌生化鉴定条，37 ℃培养24 h，记录实验结果。
分子生物学鉴定：将分离菌株D2接种到MRS肉汤培养基，37 ℃培养24 h，取1 mL菌液12 000×g离心5 min后，弃上清，取菌体沉淀用作DNA提取，具体操作按照土壤基因组DNA快速抽提试剂盒说明书进行。以提取的基因组DNA为模板对分离菌株的16S rDNA基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：DNA 1 μL，PCR引物27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL、双蒸水（ddH2O）22 μL；PCR扩增程序参照王志山等[7]的方法进行。PCR扩增产物送到上海生工生物工程股份有限公司进行纯化和测序。测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行比对搜索[8]，选取与分离菌株同源性较高的10株模式菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 6.06软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树[9]。
1.3.3 分离菌株对乙醇的耐受性
将分离菌株接种到30 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养24 h。分别取以上培养液600 μL接种到30 mL含0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（V/V）乙醇的MRS肉汤培养基中，接种3个平行，37 ℃静置培养24 h，取200 μL培养液到96孔板，用Synergy HTX多功能微孔板检测仪测定OD600nm值。
1.3.4 分离菌株的产酸能力
取300 μL分离菌株培养液接种到30 mL MRS液体培养基，接种3个平行，37 ℃静置培养24 h、48 h、72 h，将培养液12 000×g离心10 min，取上清液测定总酸和有机酸组成。总酸含量（以乳酸计）测定：参照文献[10]采用滴定法测定。有机酸含量测定：以MRS肉汤培养基为空白，参照文献[11]采用高效液相色谱法测定。
1.3.5 分离菌株对抗生素的敏感性
将100 μL分离菌株培养液涂布到MRS固体平板，将抗生素纸片放在MRS固体平板上，37 ℃培养24 h，每种抗生素纸片做3个平行，观察抑菌圈情况[12-13]。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌菌株的分离纯化
通过MRS固体培养基从桃果醋醋醅中分离纯化得到一株溶钙圈最大的菌株，编号为D2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：1.16283
2.2 菌株D2的鉴定
2.2.1 形态观察结果
菌株D2在MRS固体培养基上培养48 h的菌落及细胞形态见图1。由图1可知，菌株D2的菌落突起、表面光滑、边缘整齐、乳白色、不透明，菌落大小为1～2 mm，与胡博等[14]鉴定的鼠李糖乳杆（Lactobacillus rhamnosus）菌菌落形态一致。用革兰氏染色液染色后，在油镜下观察细胞形态，其为短杆状、单个或线性排列，这与COLLINS M D等[15]报道的鼠李糖乳杆菌标准菌株的细胞形态一致。
图1 菌株D2的菌落（a）及细胞（b）形态
Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strain D2
2.2.2 生理生化试验结果
挑取1个单菌落到2 mL无菌生理盐水制成菌悬液，采用海博生物HBI乳酸菌生化鉴定条进行生理生化鉴定，发酵七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、菊糖和乳糖均为阳性，发酵棉籽糖为阴性，与鼠李糖乳杆菌标准菌株（JCM1136）[16-17]糖发酵能力一致。
2.2.3 分子生物学鉴定结果
菌株D2的16S rDNA基因序列碱基长度为1 491 bp，其序列与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）JCM 1136相似性最高，相似性为98.21%，其次与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC 393相似性为97.31%。选取与菌株D2 16S rDNA基因序列相似性最高的10株模式菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育树，结果见图2。由图2可知，菌株D2与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）JCM 1136聚于一支，亲缘关系最近，因此，结合形态观察、生理生化试验结果，鉴定菌株D2为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。鼠李糖乳杆菌已被列为《可用于食品的菌种名单》，是公知的无毒、无副作用的益生菌，可用于食品发酵。
图2 基于16S rDNA基因序列菌株D2的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain D2 based on 16S rDNA gene sequences
2.3 菌株D2对乙醇的耐受性试验结果
菌株D2在含不同体积分数乙醇的MRS肉汤培养基中的生长情况见图3。
图3 菌株D2的乙醇耐受性试验结果
Fig.3 Results of ethanol tolerance tests of strain D2
由图3可知，菌株D2在所有接种的培养基中都有生长，且在含体积分数0～4%乙醇的MRS肉汤培养基中生长能力基本一致，OD600nm值明显比体积分数6%～14%乙醇的高，说明0～4%乙醇体积分数对菌株D2生长没有表现出抑制现象。当乙醇体积分数为6%～14%，随着乙醇体积分数的增加，菌株D2的OD600nm值逐渐减少，说明乙醇体积分数越高，对菌株D2的生长抑制性越强。金丹等[18]研究了12株乳酸菌的乙醇耐受能力，仅有3株菌在乙醇体积分数14%下还能存活，存活率≤2%，其中有一株存活率为2%的菌株为鼠李糖乳杆菌；刘威良等[19]研究了10株不同乳酸菌菌种的乙醇耐受能力，其中嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）相比其他7株乳酸菌具有更强的乙醇耐受能力；本研究中菌株D2在乙醇含量14%下还具有一定的生长能力，且菌株D2也为鼠李糖乳杆菌，推测鼠李糖乳杆菌类可能带有乙醇耐受基因。
2.4 菌株D2产酸能力分析结果
菌株D2发酵液中的总酸含量见图4。
图4 菌株D2发酵液中的总酸含量
Fig.4 Total acid content in fermentation broth of strain D2
由图4可知，菌株D2发酵24 h时，发酵液中总酸含量为16.4 g/L，发酵48 h时总酸含量为20.03 g/L，发酵72 h时总酸含量为19.97 g/L，表明发酵48 h时，发酵液中总酸含量基本趋于稳定。采用高效液相色谱仪检测发酵48 h的发酵液中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、奎宁酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、富马酸等有机酸含量，具体结果见表1。由表1可知，发酵液中乳酸含量最高，为（17.45±0.06）g/L，其次是乙酸（4.06±0.04）g/L和柠檬酸（1.35±0.07）g/L，乳酸含量增加最多，其次是苹果酸和琥珀酸。柠檬酸含量低于MRS肉汤培养基，酒石酸、奎宁酸和富马酸未检出。可能是由于乳酸菌在厌氧条件下将丙酮酸代谢成乙酸和H+，H+将延胡索酸还原成琥珀酸，导致发酵液中乙酸和琥珀酸含量增加[20]。草酸、琥珀酸和苹果酸是三羧酸循环途径的中间代谢物，其在发酵过程中不会积累太多[21]。菌株D2发酵液中总酸含量为20.03 g/L，陈卓等[22]从四川麸醋醋醅中分离到的鼠李糖乳杆菌总酸含量仅为1.97 g/L。
表1 菌株D2 48 h发酵液中有机酸检测结果
Table 1 Determination results of organic acids in fermentation broth of strain D2 at 48 h g/L
注：“－”表示未检出。
2.5 菌株D2对抗生素的敏感性试验结果
菌株D2对抗生素的敏感试验结果见表2和图5。由表2及图5可知，菌株D2对四环素、酰胺醇类（氯霉素）、大环内酯类（红霉素、吉他霉素）敏感，对氨基糖苷类（链霉素、卡那霉素）、青霉素类（青霉素、苯唑西林）和黄胺类（复方新诺明）具有抗性。菌株D2对氨基糖苷类敏感这一试验结果与NAWAZ M等[23]的研究结果一致，乳酸菌类对链霉素和卡那霉素具有抗性。菌株D2对四环素具有抗性，而SHARMA P等[24]研究了9株鼠李糖乳杆菌的抗生素敏感性，其中仅有一株对四环素具有抗性，说明菌株对四环素类抗生素的敏感性存在个体差异。
表2 菌株D2抗生素敏感试验结果
Table 2 Results of antibiotic susceptibility tests of strain D2
注：“R”表示具有耐药性；“I”表示具有中介；“S”表示具有敏感性。
图5 菌株D2抗生素敏感效果
Fig.5 Effect of antibiotic susceptibility of strain D2
1～12为表2中抗生素相应的编号。
3 结论
通过MRS固体培养基从桃果醋醋醅中分离到1株具有强产酸能力的乳酸菌，编号为D2，经形态观察、生理生化试验及分子生物学技术鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。该菌株在体积分数4%乙醇下能够正常生长，在体积分数14%乙醇下能够存活，具有较强乙醇耐受力；在MRS肉汤培养基中发酵48 h时，总酸含量达到20.03 g/L，其中乳酸含量增加最多，其次是苹果酸和琥珀酸；对四环素、酰胺醇类（氯霉素）、大环内酯类（红霉素、吉他霉素）敏感，对氨基糖苷类（链霉素、卡那霉素）、青霉素类（青霉素、苯唑西林）和黄胺类（复方新诺明）具有耐药性。该菌株具有较强的乙醇耐受能力和产乳酸能力，安全性高，有一定的开发利用价值。
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