菠萝（pineapple）又名凤梨、露兜子等，是凤梨科凤梨属多年生草本植物。其果肉酸甜可口，气味芳香独特，具有生津止渴、健胃助消化的作用[1]。菠萝原产美洲热带地区，我国种植区域主要分布在广东、福建、广西、台湾等省区，是目前华南主产区外销水果之一[2]。菠萝富含糖类、有机酸、维生素和矿物质，其饱和脂肪、胆固醇和钠含量非常低[3-4]。此外，据MHATRE M等[5-6]报道，菠萝含有的绿原酸、没食子酸和阿魏酸等丰富酚类化合物，已被证明具有抗氧化、抗诱变、降血脂和抗癌作用。菠萝浆是制造菠萝果酱和浓缩菠萝汁的必经中间产物，目前对于菠萝的研究以菠萝复合饮料和菠萝果酒等加工产品为主，或将菠萝制粉添加到饼干、糕点中增加风味[7-9]。
乳酸菌（lactic acid bacteria）是发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性菌的统称。目前大多数益生菌食品均以乳制品为基础，但这对于乳糖不耐受或对蛋白质过敏的消费者造成不便。相比之下，乳酸菌发酵果蔬既保留了果蔬本身丰富的营养物质、增加其风味，还赋予了饮品更高的营养保健价值[10]，具有改善胃肠道、抗氧化、控制血清胆固醇含量的益生作用[11]。沈燕飞[12]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为适宜苹果原浆发酵的乳酸菌，发酵5 d具有良好的抗氧化活性和感官评价；杨立启[13]研究表明，植物乳杆菌在柑橘全果汁中具有较强的发酵能力，其发酵体系中黄酮和多酚含量明显高于另两者发酵体系。菠萝全果浆富含膳食纤维，目前对益生菌直接发酵菠萝浆的研究并不多，随着人们对于健康饮食关注的提高，传统的菠萝加工产品已不能满足消费者日益增长的需求，因而开拓营养丰富、风味独特的乳酸菌发酵菠萝饮料有着广阔的市场前景[14]。
乳酸菌能够在天然菠萝汁中良好生长，无需额外补充营养素。故本实验直接以菠萝浆为原料，分别接种不同乳酸菌进行发酵，测定发酵24 h后的酶活力、抗氧化活性和挥发性成分，以探究乳酸菌对发酵菠萝浆品质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菠萝：市售；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，Lc）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）：本实验室保存；MRS肉汤培养基、酪蛋白：广东环凯微生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活试剂盒：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸（标准品）：美国Sigma-Aldrich公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Cary Eclipse型荧光分光光度计：美国VARIAN 公司；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；UV-1800型分光光度计：日本岛津公司；SPX-250B-Z生化培养箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SYNERGY H1多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；6890N/5975B型气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国安捷伦科技有限公司；57060-U固相微萃取手动进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取纤维头：美国SUPELCO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菠萝浆的制备
挑选成熟度相似的菠萝（七、八成熟），削皮去眼，将菠萝洗净，切片打浆即为菠萝浆，贮藏于-20 ℃冰柜库中备用。
1.3.2 菌种培养物制备
3株乳酸菌Lc、Lp和Lm及其保藏物置于灭菌后的MRS肉汤培养基进行活化复壮，30 ℃静置发酵12 h。
1.3.3 接种及发酵
菠萝浆分别接种复壮后的Lc、Lp和Lm（菌悬液浓度约为106 CFU/mL），进行单一、两两复配及三者复配发酵（复合菌种配比为1∶1和1∶1∶1），接种量为0.5%，于30 ℃恒温静置发酵24 h。
1.3.4 测定方法
蛋白酶酶活测定：采用福林酚法，参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》进行[15]。
SOD酶活力的测定：采用SOD活性检测试剂盒测试。将发酵液过滤，取上清液为实验样品。样品液与工作液充分混匀后置于37℃的恒温水浴40min，再各加入显色剂2.00mL，最后混匀室温放置10 min，于波长550 nm处测定吸光度值。采用1 cm直径比色皿，双蒸水调零，比色。SOD酶的活力计算公式如下：
总酚含量的测定：参考SINGLETON V L等[16-17]的方法略作修改。准确配制质量浓度为0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的没食子酸系列标准溶液。各取400 μL标液，分别加入1 mL 1 mol/L的福林酚试剂，用超纯水定容至2 mL，室温条件下避光静置10 min，加入5 mL 5%Na2CO3溶液，混匀后于室温条件下反应45 min，利用酶标仪在波长760 nm处测定溶液的吸光度值，以没食子酸溶液的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。用样液代替没食子酸标液重复上述操作，测定样液的吸光度值，结果以每克样品中所含的没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mgGAE/g）。
清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的测定：参考SOKOLLETOWSKA A等[18]的方法，取50 μL 50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L Trolox标准溶液或稀释后的样品，混合150 μL DPPH溶液共同置于96孔细胞板中，暗处放置30 min后，于波长517 nm处测定吸光度值。结果以每克发酵液中所含的Trolox当量（Trolox equivalent，TE）表示（μmol TE/g）。
维生素C含量的测定：参照傅维等[19]的方法，并作适当修改。精密称取约0.2 g 粉状样品，加入10 mL 2%草酸，摇匀静置10 min，加0.2 g活性炭，充分振荡后离心过滤后取上清液。分别吸取样品滤液1 mL 于试管加入1 mL 250 g/L乙酸钠溶液，充分混匀，在暗处放置20 min。避光条件下迅速向各试管加入1 mL 0.2 g/L邻苯二胺溶液，混匀后避光反应40 min，测定各管的荧光强度。根据抗坏血酸标准曲线方程来计算样品维生素C（mg/g）的含量。
挥发性风味物质分析：采用顶空固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）和气相色谱-质谱联用技术分析发酵前后的菠萝浆/汁的挥发性风味物质[20]。样品经GC-MS分析，各分离组分利用计算机谱库（美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）/WILEY）进行检索，当匹配度＞80%（最大值为100%）时，予以确认并记录，并采用色谱峰面积归一化法进行相对定量。
1.3.5 数据处理与分析
以上测定均重复3次，用SPSS 23.0和Origin 2018软件对实验数据进行统计分析和图形绘制。
2 结果与分析
2.1 菠萝浆发酵后蛋白酶活力的变化
由图1可知，菠萝浆经24 h发酵后，蛋白酶活力显著下降（P＜0.05）；未发酵组蛋白酶活力最高，为946.56 U/mL；干酪乳杆菌和植物乳杆菌单独发酵菠萝浆蛋白酶活力分别为813.22 U/mL和821.00 U/mL，略高于肠膜状明串珠菌单独发酵及两种乳酸菌复配发酵菠萝浆，但差异不显著（P＞0.05）；3种乳酸菌共同发酵的蛋白酶活力最低，仅为698.78 U/mL。说明添加乳酸菌发酵24 h对增加菠萝的蛋白酶活力无显著作用，这可能是乳酸菌自身产蛋白酶能力弱，菠萝含有丰富的活性菠萝蛋白酶和矿物质，微量金属离子对菌体的生长、蛋白酶合成有一定影响，另一方面蛋白酶活性容易受到发酵环境和微生物产热产气的影响，故导致了各组蛋白酶活力有所差异[21]。
图1 不同乳酸菌发酵对菠萝浆蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the protease activity of pineapple pulp
不同小写字母表示不同组间差异显著（P＜0.05），组1为未发酵组，组2为Lc单一发酵，组3为Lp单一发酵，组4为Lm单一发酵，组5为Lc+Lp（1∶1）复配发酵，组6为Lc+Lm（1∶1）复配发酵，组7为Lp+Lm（1∶1）复配发酵，组8为Lc+Lp+Lm（1∶1∶1）复配发酵。下同。
2.2 菠萝浆发酵后SOD酶活的变化
由图2可知，添加乳酸菌发酵对菠萝浆的SOD酶活性无显著性影响（P＞0.05），其中干酪乳杆菌和肠膜状明串珠菌复配发酵组的SOD酶活性最高，为98.48 U/g，未发酵组的SOD酶活力为97.99 U/g，干酪乳酸菌单独发酵和肠膜状明串珠菌单独发酵的SOD活力分别为97.70 U/g和97.12 U/g。可能是菠萝浆天然存在超氧自由基清除因子，加乳酸菌发酵24 h后发酵体系的pH值和溶氧量并未影响到SOD酶活性，故菠萝浆的SOD酶活性仍维持在高水平[22]。
图2 不同乳酸菌发酵对菠萝浆超氧化物歧化酶活力的影响
Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the SOD activity of pineapple pulp
2.3 菠萝浆发酵后总酚含量的变化
由图3可知，菠萝浆经过不同乳酸菌发酵后总酚含量有所变化。未发酵组的总酚含量为0.47 mg GAE/g，干酪乳杆菌单独发酵组的总酚含量最高，为0.51 mg GAE/g，其次是植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌复配发酵组、肠膜状明串珠菌单独发酵组，总酚含量分别为0.49 mg GAE/g和0.48 mg GAE/g。3种乳酸菌共同发酵组的总酚含量显著低于其他发酵组（P＜0.05），为0.44 mg GAE/g。菠萝浆的总酚含量在添加菌种发酵24 h后有所增加，这可能是在发酵过程中乳酸菌产生了酯酶和酚酸脱羧酶，菠萝经打浆处理后糖、纤维素及蛋白质等大分子较好地被降解利用，使得与之结合的酚类物质被释放出来，可溶性酚类物质含量升高[23-24]。据段希宁等[25]的研究，总酚含量维持在较高水平的另一点原因可能是乳酸菌在发酵过程中产生的有机酸能防止酚类物质的降解从而导致总酚含量的增加。此次试验中干酪乳杆菌和肠膜状明串珠菌复配发酵组以及3种乳酸菌共同发酵组的总酚含量有所下降，推测原因可能是发酵过程中乳酸菌的生物降解作用或是产生多种酶系水解营养物质，促使多酚物质发生不同程度的水解或聚合，此外发酵样品中存在溶解氧也会导致酚类化合物的氧化[26]。
图3 不同乳酸菌发酵对菠萝浆总酚含量的影响
Fig.3 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on total phenol content of pineapple pulp
2.4 菠萝浆发酵后DPPH自由基清除能力的变化
由图4可知，菠萝浆未发酵组的Trolox等效抗氧化能力为5.08 μmol TE/g，加乳酸菌发酵24 h后3种乳酸菌共同发酵组的抗氧化能力显著低于植物乳杆菌单独发酵组（P＜0.05），为4.91 μmol TE/g，植物乳杆菌单独发酵表现最佳，抗氧化能力达到5.37 μmol TE/g，其次为肠膜状明串珠菌单独发酵组，为5.25 μmol TE/g，干酪乳杆菌和肠膜状明串珠菌复配发酵组也能达到5.19 μmol TE/g，说明了乳酸菌发酵有利于提高菠萝浆DPPH自由基清除能力。相关研究表明[28-31]，自由基清除能力与酚类物质含量具有正相关性，发酵后菠萝浆总酚含量处于较高水平有助于增强其抗氧化活性，这可能是由于酚类物质提供了氢离子，并通过共振杂化而达到稳定，从而导致DPPH自由基清除能力升高[32]。
图4 不同乳酸菌发酵对菠萝浆DPPH自由基清除能力的影响
Fig.4 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on DPPH free radical scavenging ability of pineapple pulp
2.5 菠萝浆发酵后维生素C含量的变化
由图5可知，未发酵组的维生素C含量为4.44 mg/g，肠膜状明串珠菌单独发酵组的维生素C含量为4.73 mg/g，而其他发酵组的维生素C含量均显著下降（P＜0.05）。其中干酪乳杆菌单独发酵组、植物乳杆菌单独发酵组以及植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌复配发酵组，维生素C含量分别降至3.43 mg/g、2.83 mg/g和2.83 mg/g。维生素C含量的减少可能是维生素C自身不稳定，极易氧化分解，加之在发酵过程中可能作为碳源被乳酸菌代谢利用，在冻干制粉贮藏过程中也会造成一定损失[33]。此次试验中肠膜状明串珠菌单独发酵菠萝浆使维生素C含量保持在高水平，推测原因可能是肠膜状明串珠菌产乳酸和苯乳酸的能力较强[34]，有机酸的积累使样品内部呈现酸性环境，而维生素C在酸性环境下较为稳定。
图5 不同乳酸菌发酵对菠萝浆维生素C含量的影响
Fig.5 Effects of different lactic acid bacteria fermentation on vitamin C content in pineapple pulp
2.6 菠萝浆发酵后挥发性物质的变化
菠萝浆经乳酸菌发酵后检测出的挥发性物质成分如表1所示。
由表1可知，8组样品分别鉴别出23、29、28、24、19、23、30、22种成分，在所有样品中，酯类化合物的数量和含量在所有挥发性成分中均最高，共检出17种酯类，含量最多的是3-甲硫基丙酸甲酯、3-甲硫基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸甲酯。其次是醛酮类和醇类，分别检出12种和11种，醛酮类物质主要是2-庚酮、2-壬酮和β-环柠檬醛，醇类物质以正辛醇、2-庚醇和异戊醇为主，酸类的含量相对较少。未发酵的菠萝浆检测出的酯类成分占总挥发性物质50%以上，主要为2-甲基丁酸甲酯（27.96%）、3-甲硫基丙酸甲酯（21.31%）和己酸甲酯（10.71%），张峻松等[35]研究菠萝挥发性组分也发现酯类最多（15种），与本实验结果大致相符，说明菠萝的主要芳香物质是酯类。由表1亦可知，菠萝浆经过不同乳酸菌发酵后部分酯类含量有所下降，但挥发性物质的总数量有明显的增加，主要表现在增加了醇类和醛酮的数量，其中使用干酪乳酸菌和植物乳杆菌单独发酵的菠萝浆酯类、醇类和酚类等各物质的数量和含量均处在较高水平。植物乳杆菌单独发酵组的醇类、醛酮类、酚类和烃类分别增加了2、1、1和2种。菠萝浆经干酪乳酸菌单独发酵后增加了异戊醇（14.35%），而2-甲基丁酸甲酯的含量由原本的27.96%降至14.01%。
表1 菠萝样品中主要挥发性物质GC-MS测定结果
Table 1 Determination results of main volatile substances in pineapple samples by GC-MS
续表
注：“ND”表示未检出。
3 结论
添加乳酸菌发酵有利于维持菠萝浆的酶活性和抗氧化能力，发酵后的菠萝浆芳香成分有所增加。乳酸菌单一发酵效果要好于复配发酵，其中干酪乳杆菌单独发酵可使菠萝浆的SOD酶活保持在97.70 U/g，总酚含量达到最高（0.51 mg GAE/g），对冻干成粉后维生素C的保护作用也较可观；植物乳杆菌单独发酵菠萝浆时蛋白酶活性最好（821.00 U/mL），同时其DPPH自由基清除能力最高，达到5.37 μmol TE/g；肠膜状明串珠菌单独发酵组的维生素C含量最高，达到4.73 mg/g；菠萝浆经干酪乳酸菌和植物乳杆菌单独发酵后，酯类、醇类和酚类等各物质的数量和含量均处在较高水平，鉴定出的挥发性成分分别达到29和28种。综上，将菠萝果肉进行打浆处理后，选择干酪乳杆菌或植物乳杆菌单独发酵能获得较好的品质，可为菠萝加工以及开发相关菠萝乳酸菌发酵产品提供一定的参考。
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