酱香型白酒生产过程中会产生大量酒糟，其主要是由高粱、小麦和稻壳等废弃固形物组成。酒糟中含有丰富的营养成分[1]，常用于制备动物饲料[2-3]和肥料[4-5]。微生物发酵处理是用于改善酒糟品质生产饲料和有机肥的有效手段，在发酵过程中，微生物可以产生一些复杂的酶系，从而改善酒糟的品质，其主要有单菌种发酵[6]和复合菌种发酵[7]技术。目前报道的关于酱香型酒糟的研究主要是在动物饲料、食用菌栽培和功能性微生物筛选分离等方面的应用。郑应家等[8]在荷斯坦奶牛日粮中添加发酵后的酱香型酒糟，结果表明此举可以提高饲料的利用率，提升奶牛的产奶量，延长泌乳周期。陆承云等[9]研究了酱香型酒糟栽培姬松茸的效果，结果表明酱香型酒糟可以用于姬松茸的栽培，但应控制酒糟的添加量。白成松等[10-11]从酱香型酒糟中筛选到了对酒糟纤维素有一定降解效果的高温放线菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），在酒糟综合利用方面具有一定的潜力。关于酱香型酒糟来源的功能性微生物改善酱香型酒糟品质和挥发性成分影响的报道较少。
库德里阿兹威（氏）毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齿菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）是从酱香型酒糟和大曲中筛选分离出的两株产香菌，其对酒糟微环境的耐受能力有明显优势，并且能够产生多种纤维素酶，在酒糟纤维素降解方面具有一定的潜力。本试验利用两株优良菌种对废弃酒糟进行固态发酵处理，通过测定酒糟的微生物指标、理化指标和挥发性成分，探究两株优良菌种对酒糟品质的改善效果和挥发性成分的影响，以期为后期酱香型酒糟发酵工艺优化处理提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试剂
酒糟取自茅台镇酱香型白酒酒厂粹沙酒糟；库德里阿兹威（氏）毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齿菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）为实验室从酱香型酒糟和酱香大曲中分离的产香功能菌，均由贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保存；植物金属硫蛋白酶联免疫分析试剂盒：上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、pH自然。以不加琼脂的培养基制成PDA液体培养基。
麸皮培养基：15 g麸皮装于50 mL摇瓶中，加入15 mL蒸馏水，搅拌均匀后于121 ℃下灭菌20 min。
营养琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Thermo CR3i多功能冷冻离心机：美国赛默飞世尔科技公司；HP 7890/5975C气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪：美国安捷伦公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母种子液
将毕赤酵母（FBKL2.0008）接种到PDA斜面上30 ℃活化两次，再接种到100 mL PDA液体培养基中，在30 ℃条件下培养1 d制成酵母种子液，用于酒糟发酵。
1.3.2 白耙齿菌扩大培养
将白耙齿菌（FBKL3.0021）接种到PDA斜面上30 ℃活化两次，再接种到PDA斜面中，30 ℃生长7 d，加入5 mL生理盐水，用接种环刮下培养基上菌丝，混匀，取1 mL接种到麸皮培养基中，搅拌均匀，在30 ℃条件下培养3 d，制成扩大培养基。
1.3.3 酱香型酒糟微生物指标测定
对粹沙酒糟的细菌、霉菌和酵母数量分别计数，细菌用营养琼脂培养基计数，酵母和霉菌用PDA培养基计数。
1.3.4 酱香型酒糟部分理化指标的测定
酒糟中水分、淀粉和还原糖含量测定参考T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》；粗纤维的含量参考GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维测定方法》中的过滤法测定[13]；粗蛋白的测定参考GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》中的凯氏定氮法[14]；粗脂肪含量的测定参考GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》[15]；粗灰分含量的测定参考GB/T 6438—2007《饲料中粗灰分的测定》[16]；多糖含量测定参考董钰明等[17]的方法。无氮浸出物计算公式如下：
无氮浸出物（%）=100%-（水分%+粗蛋白%+粗脂肪%+粗纤维%+粗灰分%）
1.3.5 酱香型酒糟金属硫蛋白含量的测定
金属硫蛋白的提取：取研磨酒糟1 g，加入10 mL 0.1 mol pH8.6的Tris-HCl缓冲液，用电动玻璃匀浆器在冰浴条件下充分搅拌，匀浆液放于4 ℃，浸提5～8 h后于4 ℃、12 000 r/min离心15 min；收集上清液，并于100 ℃水浴加热5 min，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液中加入3倍体积无水乙醇于-20 ℃过夜；取沉淀，加入2 mL 0.01 mol/L Tris-HCI缓冲液室温溶解4 h，然后于4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集上清，此即为金属硫蛋白粗提取液。根据植物金属硫蛋白酶联免疫分析试剂盒操作说明测定样品中金属硫蛋白含量。以上理化指标均平行测定3次，结果取平均值。
1.3.6 酱香型酒糟挥发性成分测定
取酒糟样品约5 g，置于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取头的手动进样器，在50 ℃左右顶空萃取30 min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解析3 min进样。
色谱柱为ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温40 ℃（保留2 min），以4 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；柱前压7.62 psi，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5 min；离子源为电子电离源（electron ionization，EI）；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 428 V；接口温度280 ℃；质量范围20～450 amu。
对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley275标准质谱图，确定了挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。
1.3.7 菌株发酵
酵母发酵：在前期预试验的基础上，选择锥形瓶薄膜封口方式进行发酵。称取100 g酒糟，调节pH5～6，接种酵母10%（V/V），发酵时间为7 d，发酵温度为28 ℃。
白耙齿菌发酵：在前期预试验的基础上，选择锥形瓶薄膜封口方式进行发酵。称取20 g酒糟（在60 ℃下烘干10 h），加20 mL蒸馏水，调节pH5～6，按体积分数10%接种白耙齿菌扩大培养基，发酵时间为7 d，发酵温度为30 ℃。
发酵结束后，测定酒糟的微生物指标、理化指标和挥发性成分。
2 结果与分析
2.1 酱香型酒糟微生物指标计数结果
酒糟发酵前后微生物计数结果见表1。由表1可知，原酒糟中主要的微生物为细菌属，未检测出酵母和霉菌，经酵母和白耙齿菌发酵后，各项微生物指标的数量均显著增加。其中，酵母组中共检测出细菌1.68×107 CFU/g和酵母6.00×107 CFU/g；白耙齿菌组共检测出细菌、酵母和霉菌三种微生物，其数量分别为2.10×106 CFU/g、7.90×105 CFU/g和3.00×103 CFU/g。
表1 酒糟发酵前后微生物计数结果
Table 1 Microbe count results of distiller's grains before and after fermentation
由微生物指标计数结果可知原酒糟中微生物种类较为单一，其原因可能是因为酱香型酒糟中pH值较低[18]，微生物如霉菌等无法在这种极端pH值环境中生长；其次，本试验所用的毕赤酵母和白耙齿菌均能利用酱香型酒糟进行生长和代谢，且白耙齿菌对酒糟的利用程度优于酵母。
2.2 酱香型酒糟部分理化指标测定结果
由图1可知，原酒糟中水分含量达65.19 g/100 g，发酵后，其水分含量的变化较小，其中，酵母组的水分含量为62.93 g/100 g，白耙齿菌组的水分含量为59.43 g/100 g。
图1 酱香型酒糟部分理化指标测定结果
Fig.1 Determination results of part physicochemical indexes of sauce-flavor distiller's grains
原酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、无氮浸出物和淀粉的含量分别为8.42 g/100 g、2.90 g/100 g、4.18 g/100 g、3.24 g/100 g、16.07 g/100 g和13.67 g/100 g。经酵母菌发酵后，酒糟中粗脂肪、粗纤维、粗灰分和淀粉含量均有所下降，其中淀粉含量为9.19 g/100 g，下降了32.77%，粗脂肪、粗纤维和粗灰分下降幅度较小，分别为2.68 g/100 g、3.95 g/100 g和2.78 g/100 g；而酒糟中粗蛋白和无氮浸出物的含量有所上升，分别为8.7 g/100 g和18.96 g/100 g。白耙齿菌组酒糟成分的变化程度最大，酒糟中粗脂肪、粗纤维、粗灰分和淀粉含量下降明显，分别为0.61 g/100 g、2.76 g/100 g、2.08 g/100 g和5.17 g/100 g，与原酒糟相比，白耙齿菌组酒糟的粗脂肪和淀粉含量分别下降78.97%和62.18%；粗蛋白和无氮浸出物的含量分别上升了10.69%和60.55%，达到9.32 g/100 g和25.8 g/100 g。
原酒糟中多糖、还原糖和金属硫蛋白的含量分别为520.00mg/100g、200.00mg/100g和5.80mg/100g，白耙齿菌组酒糟的多糖、还原糖含量均比原酒糟低，分别为86.41mg/100 g、62.50 mg/100 g，金属硫蛋白含量变化不大，为5.90 mg/100 g而酵母组中多糖含量为630.00 mg/100 g，上升21.15%，但还原糖含量却下降至140.00 mg/100 g，金属硫蛋白含量上升至6.80 mg/100 g。
在酱香型白酒生产过程中，控制原料的适宜参数，如水分、粗蛋白和淀粉含量等是生产过程中的关键点之一。本试验所用的粹沙酒糟与茅台酒糟[19]相比，除水分含量和无氮浸出物含量稍高，其余理化指标均低于茅台酒糟，其原因可能是发酵原料种类、配比和生产工艺的不同，造成固态发酵白酒酒糟的营养物质种类和含量的差异[1]。金属硫蛋白是微生物与动植物产生的金属结合蛋白[20]，其在保健品和化妆品领域的应用前景广泛，因此在研究开发酒糟丢糟产品用于生产保健品时，企业要求将此项指标考虑在内。本试验中酵母组的金属硫蛋白含量有所上升，其原因可能是酵母组中细菌和酵母的生物量远高于其余两组，而在本试验中金属硫蛋白主要来源于微生物，因此推测金属硫蛋白含量的升高可能与酵母组中的生物量有关，但确切的原因还需进一步研究。综上所述，试验中所用毕赤酵母和白耙齿菌均能够改善酒糟的品质，但两者之间也存在差异，这与游玲等[21]的研究结果一致。白耙齿菌对酒糟品质的改善效果优于毕赤酵母，但金属硫蛋白含量低于毕赤酵母组，因此，在后续酱香型酒糟产品开发时可以考虑将两者结合，进行混菌发酵。
2.3 酱香型酒糟挥发性成分含量测定结果
由表2可知，原酒糟中共检出54种挥发性成分，其中酯类29种、醛类8种、醇类6种、酸类3种、酚类和酮类各1种、烷类和其他类各2种；构成原酒糟中挥发性成分的物质主要是酯类（47.3%）、醇类（27.7%）和酸类（13.4%）。酵母组中挥发性成分共检出44种，其中酯类28种、醛类7种、醇类6种、酚类、酸类和其他类各1种；构成其挥发性成分主体物质是酯类（57.9%）和醇类（30.9%）。白耙齿菌组共检出37种挥发性成分，其中烯类23种、醛类6种、醇类3种、酮类2种、酯类和酚类各1种；其挥发性成分主体物质是烯类（48.7%）、其他类（22.1%）和酮类（13.1%）。
表2 酒糟发酵前后挥发性成分相对含量
Table 2 Relative contents of volatile components in distiller's grains before and after fermentation%
续表
续表
注：“--”表示未检出。
发酵后的酒糟中挥发性成分的种类和含量各不相同，其中原酒糟中挥发性成分最多，酵母组次之，白耙齿菌组中最少。并且各试验组中挥发性成分主体物质也存在一定差异，原酒糟和酵母组中挥发性成分主体物质均含有酯类和醇类，在检出的酯类物质中，乙酯类含量和种类最多，可能与酵母种类和酶活相关[22]，这与王轩等[23]的结果一致。而白耙齿菌组的挥发性成分主体为烯类，这与杨建远等[24]的结果不一致，后者挥发性主体物质为酯类（42.41%），但两者都具有浓郁的香气，这可能是因为两者所用原料不同所致。白耙齿菌组的挥发性成分虽然比酵母组少，但其挥发性成分主要为烯类物质，其中含量较大的有（-）-马兜铃烯（10.64%）、α-愈创木烯（9.38%）和（+）-苜蓿烯（8.17%）等，萜烯类物质普遍具有较强的抗菌活性、止痛能力和抗氧化活性等功能[25]，说明白耙齿菌发酵后的酒糟更具应用价值，更适合用于酱香型酒糟产品的开发。
3 结论
本研究结果表明，白耙齿菌组微生物的种类和数量最多，共检测出细菌、酵母和霉菌三种微生物，酵母组次之，但未检出霉菌，原酒糟中最少，只检出细菌；白耙齿菌和酵母均能利用酒糟的营养成分进行生长和代谢，且前者对于酒糟的利用程度优于后者，两株菌均能在一定程度上改善酒糟的品质；原酒糟、酵母组和白耙齿菌组分别检测出54种、44种和37种挥发性成分，且相对含量逐渐减少，原酒糟和酵母组的主要挥发性成分是酯类和醇类，而白耙齿菌组的挥发性成分主要是烯类。基于酒糟品质改善效果和挥发性成分测定结果，建议在后续酱香型酒糟发酵处理时，采用两者结合进行混菌发酵。本研究为后续发酵工艺优化处理提供了数据支撑。
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