碱性蛋白酶是一类在碱性条件下能将多肽链水解为氨基酸的酶，其最适pH值一般在9～11左右，最早发现于猪的胰脏中，属于丝氨酸蛋白酶，其活性中心含有丝氨酸，分子质量在26 000～34 000 Da[1-2]。碱性蛋白酶作为一种重要的蛋白水解酶，可广泛应用于洗涤剂行业、食品加工业、医药行业、皮革制造行业、丝绸制造行业、环保行业等[3-6]。据报道蛋白酶占全球酶制剂销售总量的60%～65%，其中碱性蛋白酶用量最大[7]。
碱性蛋白酶生产以微生物发酵法为主，目前国内碱性蛋白酶的生产效率并不高，产品供不应求，导致部分产品仍依赖进口[8]。因此，碱性蛋白酶高产菌株的缺乏已成为碱性蛋白酶生产的技术瓶颈之一。常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变育种是近年来兴起的一种诱变技术，具有射流温度低，产生的等离子体均匀，对人体安全，操作简便，成本低，与生物大分子和细胞作用明显等优点[9-11]。目前在对霉菌、细菌、酵母诱变改造方面均取得较好的效果，但利用ARTP诱变技术选育高产碱性蛋白酶鲜见报道[12]。物理化学复合诱变方式具有协同效应，比单一诱变效果更好。氯化锂（LiCl）作为化学助诱变剂，可进一步提高高产菌株的筛选几率。邱雁临等[13]利用紫外线-氯化锂复合诱变选育L-组氨酸产生菌，所得高产菌株产L-组氨酸含量比原始菌株提高13.6%，比单一紫外诱变后的菌提高5.1%；李兆飞等[14]利用氯化锂-离子束复合诱变选育高产核酸酶P1菌株，所得高产菌株酶活较原始菌株提高45.8%，比单一离子束诱变后的诱变株产酶量提升20.4%。
本研究以地衣芽孢杆菌（Bacillus chlamydiae）为出发菌株，利用常压室温等离子体（ARTP）结合氯化锂进行物理化学复合诱变。其优势在于在保证安全性的前提下，提升诱变强度，更有利于筛选出高产碱性蛋白酶的菌株，同时以单因素和响应面试验对其发酵条件进行优化，以期用于提升工业生产碱性蛋白酶发酵水平。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417：安琪酵母股份有限公司菌种保藏室。
1.1.2 试剂
牛肉膏、琼脂粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸氢二钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；玉米粉：濮阳县英伦玉米加工有限公司；豆饼粉：安阳天祥瑞食品科技有限公司；碳酸钠、氯化钠：北京西陇化工有限公司；酵母粉、葡萄糖：安琪酵母股份有限公司；酪蛋白：阿法埃莎（中国）化学有限公司。实验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
活化培养基[15]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。
酪蛋白鉴别平板培养基[16]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酪蛋白10 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。
种子培养基[17]：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。
发酵培养基[18]：玉米粉35 g/L，豆饼粉25 g/L，磷酸氢二钠2 g/L，碳酸钠1.25 g/L。按配方要求准确称取豆饼粉及玉米粉原料，加水充分溶解后加入高温淀粉酶（20 U/g玉米粉），同时边搅拌边升温至90～95 ℃液化30 min，最后加入其他原料，搅拌均匀，调pH值至7.2，121 ℃灭菌40 min备用。
1.2 仪器与设备
ARTP-M常温常压等离子体诱变仪：无锡源清天木生物科技有限公司；GHP9080隔水恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HHS4水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；TDL-608离心机：上海安亭科学仪器厂；SP-754紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；ZWYR-211D恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液的制备
将地衣孢杆菌E-417甘油管接种至种子培养基中，放置于37 ℃恒温培养箱中培养16～20 h。待菌落铺满整个茄瓶后，倒入100 mL无菌水，用无菌接种铲将菌泥洗出混匀，即得菌悬液。
1.3.2 氯化锂诱变
参考文献[19]的方法。在菌悬液中加入1.5%的氯化锂，于180 r/min、37 ℃条件下进行诱变处理10 min后待用。
1.3.3 氯化锂-ARTP复合诱变
参考文献[20]的方法。将ARTP设备开启预热，调节照射功率为120 W，照射距离为2 mm，氦气（He）流量为10 L/min，开启操作室紫外灯灭菌20 min。取10 μL菌液至无菌金属载片上，涂抹均匀。将载片放入诱变室内，对菌液诱变处理0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s。将处理好的金属载片放入无菌离心管中，加1 mL无菌水稀释至10-3，振摇3 min，再进一步稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，取100 μL菌液至酪蛋白鉴别平板培养基上，37 ℃培养20～24 h，以处理0 s为对照组，计算致死率及正突变率，其计算公式如下：
1.3.4 高产碱性蛋白酶菌株的筛选
初筛：酪蛋白是蛋白酶系的作用底物，将诱变菌液涂布至酪蛋白鉴别平板上会出现明显的水解圈，测量水解圈直径与菌落直径，并计算其比值（HC值），筛选出HC值较大的单菌落为高产碱性蛋白酶诱变株[21]。
复筛：用无菌接种铲刮取初筛得到的诱变株接种至种子培养基，于37 ℃、220 r/min条件下培养12 h后，按10%（V/V）的接种量接种于发酵培养基，于37 ℃、220 r/min条件下培养48 h，离心取上清液，测定酶活。
1.3.5 碱性蛋白酶酶活的测定
取2 mL发酵液在12 000 r/min条件下离心5 min，保留上清液，用硼酸缓冲液（pH 10.5）稀释至合适倍数，按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》规定的福林（Folin）法测定酶活力[22]。
碱性蛋白酶酶活力单位定义：在40 ℃条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活力单位（U/mL）。
1.3.6 遗传稳定性研究
将复筛得到的正突变菌株连续传代至8代，分别接种至发酵培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下培养48 h，离心取上清液，测定酶活，考察高产菌株的遗传稳定性[23]。
1.3.7 诱变株发酵产碱性蛋白酶条件优化
单因素试验：在初始发酵培养基及发酵条件基础上，采用单因素轮换法依次考察不同碳源（葡萄糖、玉米淀粉、玉米粉）、氮源（酵母粉、豆饼粉、豆粕粉）、玉米粉添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、豆饼粉添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、磷酸氢二钠添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）、碳酸钠添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）、初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接种量（4%、6%、8%、10%、12%）、发酵温度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）对碱性蛋白酶活力的影响，确定发酵培养基组分和发酵条件。
响应面试验：在单因素试验基础上，选取3个对酶活影响较大的因素，进行3水平3因素的Box-Behnken响应面试验设计[24]，以玉米粉（A）、豆饼粉（B）、碳酸钠（C）添加量为自变量，以碱性蛋白酶酶活（Y）为响应值进行进一步优化。采用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据结果进行分析，响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments
2 结果与分析
2.1 氯化锂-ARTP复合诱变结果
氯化锂是一种碱金属卤化剂，为助诱变剂，与ARTP进行复合诱变，更有利于正突变菌株的产生。采用1.5%氯化锂处理10 min后，进行ARTP诱变，将诱变时间设定在0～105 s范围内，不同诱变时间下，地衣芽孢杆菌E-417的致死率及正突变率见图1。
图1 不同LiCl-ARTP复合诱变时间下地衣芽孢杆菌E-417的致死率及正突变率
Fig.1 Fatality rate and positive mutation rate of Bacillus licheniformis E-417 by LiCl-ARTP compound mutation with different mutation time
由图1可知，菌株致死率随ARTP照射时间而增加，正突变率呈先上升后下降趋势。当诱变时间为45 s时，菌株致死率达到94.6%，正突变率为14.7%，达到最高。当诱变时间为60 s时，菌株致死率达到95.3%，正突变率骤降至8.5%。当诱变时间为75 s时，该菌株致死率已达到100%。因此氯化锂-ARTP复合诱变最佳条件为氯化锂添加量1.5%，ARTP照射45 s。
2.2 高产碱性蛋白酶菌株的筛选
将诱变后的菌液涂布至酪蛋白鉴定平板，地衣芽孢杆菌分泌的碱性蛋白酶可将酪蛋白分解为小分子氨基酸，致使菌落周围形成水解圈（见图2）[25]。经过多次的复合诱变试验，初筛得到132株HC值（3.51～4.32）较大的单菌落，再经摇瓶复筛测定酶活，最终筛选出16株发酵酶活明显高于原始菌株的诱变株，结果见表2。
图2 酪蛋白平板筛选结果
Fig.2 Results of casein plate screening
由表2可知，HC值的大小在一定程度上反映了菌株产碱性蛋白酶的能力，HC值越大，酶活越高。16株诱变菌株中，诱变株F-3与F-8的HC值及碱性蛋白酶酶活最高，故对这两株诱变株进行遗传稳定性验证。
表2 复合诱变后高产碱性蛋白酶诱变菌株的筛选结果
Table 2 Screening results of high yield alkaline protease mutant strain after compound mutation
2.3 遗传稳定性验证
为了检验诱变株F-3、F-8的遗传稳定性，对突变株F-3、F-8进行连续传代8次，并同时进行发酵培养，采用福林（Folin）法对每代菌株的发酵上清液进行酶活测定，结果见表3。
由表3可知，经过8次连续传代，2株诱变菌株均具有良好遗传稳定性，其中诱变株F-3的酶活最高，达到12 870 U/mL，较原始菌株提高了39.5%，因此，选用此菌株进行后续研究。
表3 传代8次后诱变株F-3和F-8的遗传稳定性
Table 3 Genetic stability of mutant strains F-3 and F-8 after 8 passages
2.4 诱变株F-3产碱性蛋白酶发酵条件优化单因素试验
2.4.1 不同碳源及氮源对诱变株F-3产酶的影响
由图3可知，以玉米粉为碳源时，诱变株F-3产碱性蛋白酶酶活最高为12 030 U/mL，明显高于以葡萄糖、玉米淀粉为碳源的酶活，因而选择玉米粉作为最优碳源；以豆饼粉作为氮源时，诱变株F-3产碱性蛋白酶酶活最高为13000U/mL，明显高于以豆粕粉、酵母粉为氮源的酶活，可能是由于豆饼粉粒度更细，更易被菌体代谢利用，经蛋白酶水解后产生出更多的氨基酸，进一步诱导诱变株F-3产酶。因而选用豆饼粉作为最优氮源。
图3 不同碳源及氮源对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.3 Effect of different carbon and nitrogen sources on alkaline protease production by mutant strain F-3
2.4.2 玉米粉和豆饼粉添加量对诱变株F-3产酶的影响
由图4可知，随着玉米粉和豆饼粉添加量的不断增大，碱性蛋白酶酶活均呈先上升后下降的趋势，当玉米粉和豆饼粉添加量为40 g/L时，酶活均达到最高，分别为13 536 U/mL、14 870 U/mL，因此，选择最优玉米粉和豆饼粉添加量均为40 g/L。
图4 玉米粉（a）和豆饼粉（b）添加量对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.4 Effect of corn flour (a) and soybean cake powder (b) additions on alkaline protease production by mutant strain F-3
2.4.3 磷酸氢二钠及碳酸钠添加量对诱变株F-3产酶的影响
由图5可知，随着磷酸氢二钠和碳酸钠添加量的不断增大，碱性蛋白酶酶活均呈先上升后下降的趋势，当磷酸氢二钠和碳酸钠的添加量为2.0 g/L时，酶活均达到最高，分别为13 890 U/mL、15 567 U/mL。因此，选择最优磷酸氢二钠和碳酸钠添加量均为2.0 g/L。
图5 不同金属盐添加量对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.5 Effect of different metal salts additions on alkaline protease production by mutant strain F-3
2.4.4 初始pH值对诱变株F-3产酶的影响
由图6可知，诱变株F-3对初始pH值的变化较为敏感，随着pH值的增加，碱性蛋白酶酶活呈先上升后下降的趋势。pH值过低，菌体生长缓慢，影响产酶；pH值过高发酵后期菌体老化过快，从而影响其代谢产物产量。当pH值为7.0时，发酵酶活最高为13 490 U/mL，因此，选择最优初始pH值为7.0。
图6 初始pH值对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.6 Effect of initial pH on alkaline protease production by mutant strain F-3
2.4.5 接种量对诱变株F-3产酶的影响
由图7可知，接种量对诱变株F-3产碱性蛋白酶影响较大，当接种量为4%时，由于接种量太少，菌体前期生长缓慢，产酶效率低；随着接种量的逐步提高，产酶量逐渐增加。当接种量为8%时，碱性蛋白酶酶活最高为13 212 U/mL。随着接种量的继续提高酶活反而下降，可能是由于接种量过大，菌体生长过快，菌体提前消耗完底物培养基，产生了大量代谢副产物，影响了诱变株F-3产碱性蛋白酶的能力，因此，选择最优接种量为8%。
图7 接种量对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.7 Effect of inoculum on alkaline protease production by mutant
strain F-3
2.4.6 发酵温度对诱变株F-3产酶的影响
由图8可知，随着发酵温度的提高，菌株产碱性蛋白酶活力呈先上升后下降的趋势。当发酵温度为31 ℃时，发酵温度过低，菌体生长缓慢，产物合成能力降低，发酵酶活最低；当发酵温度为37 ℃时，酶活最高为15 501 U/mL；当发酵温度高于37℃，菌体生长过快，底料培养基过早耗竭，菌体提前衰亡，酶活开始下降。因此，选择最优发酵温度为37 ℃。
图8 发酵温度对诱变株F-3产碱性蛋白酶的影响
Fig.8 Effect of fermentation temperature on alkaline protease production by mutant strain F-3
2.5 诱变株F-3产碱性蛋白酶发酵条件优化响应面试验
2.5.1 响应面试验设计与结果
根据单因素试验的结果，以玉米粉（A）、碳酸钠（B）、豆饼粉（C）添加量为自变量，以碱性蛋白酶酶活（Y）为响应值进行响应面试验优化，试验设计及结果见表4。
表4 响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface tests
2.5.2 构建数学模型及方差分析
采用Design-Expert 8.0.6软件对表4试验数据进行分析，构建数学模型。得到最终二次回归方程为：
回归方程决定系数R2=0.996 6，表示有99.68%的数据可以用该模型来解释，调整决定系数R2Adj=0.990 9，说明该方程拟合性较好，可以用于分析。
对回归方程进行方差分析，结果见表5。由表5可知，模型的P＜0.000 1，表示此模型极显著，失拟项的P=0.062 3＞0.05，说明失拟项不显著，说明模型与试验值之间的误差较小。一次项A、B及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AB对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
表5 响应面试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of response surface tests results
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极其显著（P＜0.01）。
2.5.3 响应面图分析
各因素交互作用对诱变株F-3发酵产碱性蛋白酶影响的响应面及等高线见图9。由图9可知，当3个因素中其中一个固定为零水平时，其他两个因素存在交互作用且存在一个最高的组合点，其中，碳酸钠和玉米粉交互作用较显著，响应面曲线走势较陡，有明显的最高点和最优水平，与方差分析结果一致。
图9 各因素交互作用对诱变株F-3产碱性蛋白酶的响应面和等高线
Fig.9 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on alkaline protease production by mustant strain F-3
2.5.4 响应面预测与验证
对回归方程求解产碱性蛋白酶酶活的极大值，得出培养基玉米粉、碳酸钠、豆饼粉的添加量分别为41.34 g/L、2.07 g/L、39.78 g/L，预测的产碱性蛋白酶酶活最高可达16 153.5 U/mL。为方便实际应用，将培养基调整为玉米粉41g/L、碳酸钠2.1g/L、豆饼粉40g/L。在此优化条件下进行3组平行试验，得出平均碱性蛋白酶酶活实际值为16 156 U/mL，与预测值基本吻合。说明本次试验模型对地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶具有一定指导意义。
3 结论
本研究以提高碱性蛋白酶酶活为目标，采用ARTP与氯化锂复合诱变方法对地衣芽孢杆菌E-417进行诱变，确定氯化锂添加量1.5%，ARTP照射45 s为最适复合诱变条件。对诱变后的菌株进行酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证，最终筛选出诱变株F-3为高产碱性蛋白酶的优良菌株，酶活达到12 147 U/mL，较原始菌株提高了31.7%。通过单因素及响应面试验对其发酵产碱性蛋白酶的条件进行优化。结果表明，诱变株F-3产碱性蛋白酶的最佳发酵培养基为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L；最佳发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量为8%。在此优化条件下，碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL，为进一步提高碱性蛋白酶酶活奠定基础。
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