枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今社会生产中广泛使用的一种微生物，它属于芽孢杆菌属中的一种，在自然界环境土壤、湖泊中分布极其广泛，生长繁殖过程中大部分菌株不会产生毒性物质，对人畜等生命几乎无任何毒害作用，故广受人们关注[1-3]。枯草芽孢杆菌（B.subtilis）菌体形态为杆状，产生孢子，在微生物生长代谢过程中，分泌产生许多抗菌素[4-5]和特定的酶类[6-7]等，其菌体发酵液抑菌性能较强，对多种病原菌有抑制作用，本身所产生的芽孢使其对外界生长环境有极强抗逆性能[8]。对微生物繁殖营养条件需求简单，分裂生长速度较快[9]，因而枯草芽孢杆菌（B.subtilis）产品的生产加工工艺简单、活菌存活率高。其菌体对外界环境高适应性[10]及发酵液对病原菌的抑制作用[11-12]，可以采用不同的生产工艺，产品类型灵活多变，使其成为当今社会生产中使用广泛的微生物菌种之一。
目前，国内外枯草芽孢杆菌（B.subtilis）微生物发酵工业中发酵液主要是分离出菌体生产微生物制剂或对其上清液进行提取纯化代谢产物进而生产相关产品。LI R F等[13]通过中心组合设计（central composite design，CCD）优化了生长重要参数，使枯草芽孢杆菌DB1342对白色念珠菌的生长抑制率比优化前提高30.86%。MEENA K R等[14]通过响应面法（response surface methodology，RSM）优化枯草芽孢杆菌（B.subtilis）KLP2015生产工艺参数，使其对霉菌具有抑制作用的脂肽的产量提高1.8倍。KILANI-FEKI O等[15]通过对枯草芽孢杆菌（B.subtilis）M13培养基进行优化筛选后，使抗真菌代谢产物产量比基础培养基提高93%以上。沈跃丽等[16]优化枯草芽孢杆菌发酵条件，对荧光假单孢菌及短小芽孢杆菌抑菌能力分别提高了42%和47%。汤颖秀[17]对诱变枯草芽孢杆菌产表面活性素工艺进行优化，比优化前产量提高了1.48倍。任玉文等[18]通过优化发酵工艺，使枯草芽孢杆菌菌体产量较优化前提高了3.95倍。孙沙沙等[19]优化了培养基及发酵工艺，使菌株对烟草野火病害抑菌圈直径提高了25.72%。贾田惠等[20]优化了发酵过程主要因素，使对真菌抑菌圈直径提高了72.5%。
本研究通过响应面法对1株对细菌具有较强拮抗能力枯草芽孢杆菌（B.subtilis）CGMCC5174的发酵工艺进行优化，采用细菌活菌量和抑菌物质产量为评价指标，并结合满意度函数法，以期利用一个总体满意度值来综合评价发酵液中细菌活菌总量和抑菌物质产量，从而更好地预测出发酵工艺优化参数对发酵液中活菌和抑菌物质产量的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC5174：吉林省农业科学院农产品加工研究所；大肠杆菌（Escherichia coli）CMCC44825：广东微生物种质资源库。
1.1.2 化学试剂
胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、琼脂（均为生化试剂）、氯化钠、葡萄糖（均为分析纯）：上海鼎国生物技术有限公司。
1.1.3 培养基
营养琼脂平板[21]：胰蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L，去离子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH值至7.4，121 ℃灭菌15 min。
LB液体培养基[22]：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖3 g/L，去离子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH值至6.4，121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
XSP-2C生物显微镜：日本Olympus公司；PB-10型酸度计：德国赛多利斯公司；MLS-3780高压灭菌器：日本Sanyo公司；Cary 300 UVVIS分光光度计：美国Varian公司；BCN-1360B型无菌超净工作台、HZQ-Q振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；D3024R 实验台式高速冷冻型离心机：大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；DHP-9272电热恒温培养箱、JWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；Forma-80 ℃905-ULTS超低温冰箱：赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株培养液的制备
枯草芽孢杆菌CGMCC5174种子培养液的制备：菌株甘油冻干管从-80 ℃低温冰箱中取出，放在37 ℃恒温水浴中迅速溶解。从冻干管中取出1 mL菌液加入到装液量为10 mL/250 mL LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h后，得到种子培养液，放入-4 ℃备用。
枯草芽孢杆菌CGMCC5174培养液的制备：从种子培养液中取出1.5 mL菌液加入装液量为100 mL/250 mL LB培养液中，37 ℃、150 r/min振荡培养8 h，再重复上述步骤活化2次，得到菌株CGMCC5174培养液，放入-4 ℃备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）CMCC44825培养液的制备：大肠杆菌甘油冻干管-80 ℃低温冰箱中取出，37℃恒温水浴迅速溶解。从冻干管中取出2 mL菌液加入装液量为10 mL/250 mL LB培养液中，37 ℃、170 r/min振荡培养24 h。再从培养瓶中取出1 mL菌液加入装液量为100 mL/250 mL LB培养液中，37 ℃、170 r/min振荡培养14 h，得到菌株CMCC 44825培养液，放入-4 ℃备用。
1.3.2 抑制致病菌能力检测[23]
取枯草芽孢杆菌CGMCC517培养液在8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，将滤纸片（直径8 mm）浸泡于分离得到的上清液中15 min。取大肠杆菌CMCC44825菌液50 μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，静置20 min，放上准备好的滤纸片，37 ℃恒温静置培养16 h，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈直径大小表示抑菌活性（抑菌圈直径＞8 mm，判为有抑菌作用；抑菌圈直径＜8 mm，判为无抑菌作用）。
1.3.3 枯草芽孢杆菌活菌数的测定[24]
采用平板稀释计数法测定发酵液中枯草芽孢杆菌活菌数，对操作方法稍作改动。使用无菌移液枪取出1 mL充分摇匀的枯草芽孢杆菌CGMCC517发酵液，沿试管壁缓慢注入装有9 mL无菌生理盐水的试管中，放到振荡器充分混合均匀。按着上一步骤，依次制备10倍稀释的发酵液样品，共稀释8个试管，分别标注1～8号。分别从4、7、8号管中吸取100 μL置于营养琼脂平板上，均匀涂布，放入培养箱37 ℃恒温静置培养16 h，取出后点数平板上单菌落数目，计算枯草芽孢杆菌活菌数。
1.3.4 发酵工艺优化单因素试验
按1.3.1中枯草芽孢杆菌试验培养液的培养工艺，分别设置初始pH值为（5.4、6.4、7.4、8.4、9.4），装液量（25 mL/250 mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL），接种量为（0.5 mL/100 mL、1.5 mL/100 mL、3.5 mL/100 mL、5.5 mL/100 mL、7.5 mL/100 mL），培养温度（32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃），转速（100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min），培养时间（8 h、14 h、20 h、26 h、32 h），考察初始pH值、装液量、接种量、培养温度、转速、培养时间对枯草芽孢杆菌活菌量及抑菌圈直径的影响。
1.3.5 发酵工艺优化响应面试验
（1）Plackett-Burman试验设计
在单因素试验基础上，以枯草芽孢杆菌活菌量及抑菌圈直径为响应值，选取6个因素初始pH值（A）、转速（B）、培养温度（C）、装液量（D）、接种量（E）、培养时间（F）进行Plackett-Burman（PB）试验[14]。对6个因素的最优培养条件范围分别取高、低两个水平，PB 试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for fermentation process optimization
（2）Box-Benhnken试验设计
根据上述Plackett-Burman（BB）试验结果，选择出对结果显著性影响因素摇瓶转速（X1）、装液量（X2）与培养时间（X3）进行Box-Benhnken试验优化，BB试验因素及水平见表2。
表2 发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization
1.3.6 满意度函数-响应面设计[25]
在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman试验，选择分析结果较为显著的因素，以活菌量（Y1）和抑菌圈直径（Y2）为响应值，为找到合理的优化条件，采用满意度函数法将两种响应值进行综合分析，进行发酵工艺条件的优化。采用一种高可取性的总体满意度值统计分析法见式（1）：
式中：S为总体满意度值；in为第n个数据响应值的权；An为第n个数据响应的满意度值，An定义见式（2）：
式中：Yn（X）为第n个响应值，Ln为第n个响应值的规定下限，Yn，max（X）为第n个响应值所不能超过的最大上限。
在整个试验中，发酵液中活菌量对数值均＞6.0，抑菌圈直径＞20 mm，因此在满意度函数计算中，分别规定发酵液中活菌量对数值下限为6.0，抑菌圈直径下限为20 mm，活菌量对数值不可能超过最大上限9.0，抑菌圈直径不可能超过最大上限30 mm，即可定义满意度函数为式（3）和（4）。
式中：A1和A2分别为发酵液中活菌量和抑菌圈径的满意度。取每个满意度函数的权为1，总体满意值为S（%）=
100%。
1.3.7 数据处理
应用Sigmaplot 14.0、SPSS 21.0对单因素试验数据进行分析和数据处理，Minitab 19.0进行Plackett-Burman 试验和满意度函数分析法-响应面分析数据处理。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始pH值的影响
培养基中微生物生长繁殖和菌体代谢产物生物合成都有其最适合和能够耐受的外界环境pH范围[26]。初始pH值会影响到培养基中菌体细胞膜上的电荷状态，引起细胞膜的渗透性发生不可逆性改变，进而对培养细菌的吸收营养物质和特定代谢产物能力产生影响，并对发酵液中代谢产物的稳定性同样有影响[27]。初始pH值对发酵液中活菌量及抑菌能力影响结果见图1。
图1 初始pH值对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.1 Effect of initial pH on fermentation performance of strain CGMCC5174
不同小写字母表明差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，菌株CGMCC5174初始活菌量对数值为4.27，在初始pH值5.4～9.4范围内，菌株都有不同程度的增长，但在初始pH值5.4、9.4生长情况不理想，与其他条件差异性显著（P＜0.05）。在范围7.4～8.4范围内，菌株抑菌圈直径之间差异性不显著（P＞0.05）。初始pH值7.4时菌液活菌量对数值为7.2±0.04及抑菌圈直径为（21.0±1.8）mm，显著高于其他条件抑菌圈直径（P＜0.05），这是因为初始pH值为7.4时培养环境促进了枯草芽孢杆菌的营养吸收，促进了菌株的生长繁殖，进而分泌出大量的抗菌代谢产物；但初始pH值＜7.4或＞7.4时都会影响菌株的生理状态，降低其生长繁殖速度，大大降低其分泌代谢产物的能力。因此，选择最适初始pH值为7.4。
2.1.2 摇瓶转速的影响
枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，摇瓶培养可方便地控制通气量，操作简单，微生物细胞生长较好[26，28]。摇瓶转速对发酵液中活菌量及抑菌能力影响结果见图2。
图2 摇瓶转速对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.2 Effect of rotating speed on fermentation performance of strain CGMCC5174
由图2可知，摇瓶转速＜200 r/min时，培养液中枯草芽孢杆菌无法与溶解的氧充分接触，活菌量及菌株产生抑菌性代谢产物都比较低；而摇瓶转速＞200 r/min时，对细菌细胞容易产生机械损伤，降低了发酵液中活菌量，进而降低细菌代谢产物能力；摇瓶转速为200 r/min时，发酵液中活菌量具有显著优势（P＜0.05），200 r/min，250 r/min相对于其他条件抑菌圈直径显著优势（P＜0.05），但这两组之间抑菌圈直径差异不显著（P＞0.05）。因此，选择最佳摇瓶转速为200 r/min。
2.1.3 培养温度的影响
培养温度通过影响菌株生长繁殖过程中蛋白质和酶的合成与活性，及其他各种生理代谢反应，从而影响到菌体的生理活动[26，29]。培养温度对发酵液中活菌量及抑菌能力影响结果见图3。由图3可知，42 ℃培养温度对发酵活菌量影响具有显著优势（P＜0.05），适宜的生长温度可以加快细菌细胞分裂，提高发酵液中活菌含量。37 ℃培养温度对发酵液抑菌圈直径影响具有显著优势（P＜0.05），对代谢产物影响较小，可以保持代谢产物抑菌活性。因此，选择最佳培养温度为37 ℃。
图3 培养温度对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.3 Effect of culture temperature on fermentation performance of strain CGMCC5174
2.1.4 装液量的影响
装液量直接影响到培养液中溶氧量的浓度，而好氧微生物枯草芽孢杆菌在生长繁殖阶段还是分泌抑菌代谢产物阶段都需要充足的氧气供应[30]。装液量对发酵液中活菌量及抑菌能力影响结果见图4。
图4 装液量对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.4 Effect of loaded liquid on fermentation performance of strain CGMCC5174
由图4可知，装液量为75 mL/250 mL时菌液活菌量及抑菌圈直径显著高于其他条件（P＜0.05）。装液量在25～75 mL/250 mL时，培养液中菌株生长速度会加速，因此产生抑菌代谢产物的活性也会增加；但装液量＞75 mL/250 mL后，培养环境中溶氧量降低，进而使枯草芽孢杆菌活菌量和抑菌代谢产物活性降低。因此，选择最佳装液量为75 mL/250 mL。
2.1.5 接种量的影响
接种量对发酵液中活菌量及抑菌能力影响结果见图5。由图5可知，接种量5.5 mL/100 mL、7.5 mL/100mL时菌液活菌量及抑菌圈直径显著高于其他条件（P＜0.05），但这两组相互之间活菌量及抑菌圈直径差异不显著（P＞0.05）。接种量在1.5～7.5 mL/100 mL时，发酵液中活菌量升高，接种量＞7.5 mL/100 mL后，发酵液中活菌量增缓，与5.5 mL/100 mL之间没有显著性差异（P＞0.05），可能是因为随着接种量的增加，培养环境中的营养消耗太快，导致枯草芽孢杆菌增殖过慢，菌株的代谢产物能力也下降[31]。因此，选择最佳接种量为5.5 mL/100 mL。
图5 接种量对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.5 Effect of inoculum on fermentation performance of strain CGMCC5174
2.1.6 培养时间的影响
培养时间有利于微生物生长繁殖及其代谢产物富集，枯草芽孢杆菌长时间培养后，抑菌有效成分累积达到理想状态，但到一定程度后，增速变缓，经济效益降低[32]。发酵时间对发酵活菌量及抑菌能力影响结果见图6。由图6可知，培养时间为8～14 h对发酵活菌量呈现显著增长（P＜0.05），使细胞生长繁殖由快速生长转为稳定发育期；培养26 h条件对发酵液抑菌圈直径显著优势（P＜0.05），活菌生长繁殖进入稳定发育，但其代谢产物产量同时在增加，但培养时间＞26 h之后，培养液中代谢产物累积产量会制约细胞维持抑菌物质合成的高效率，抑菌产物生产速率平缓降低。因此，选择最佳培养时间为20 h。
图6 培养时间对菌株CGMCC5174发酵性能的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation performance of strain CGMCC5174
2.2 发酵工艺优化Plackett-Burman试验
在单因素试验基础上，以活菌量（Y1）和抑菌圈直径（Y2）为响应值，选取初始pH值（A）、转速（B）、培养温度（C）、装液量（D）、接种量（E）、培养时间（F）6个因素，按照Plackett-Burman试验设计，在不同发酵培养条件下进行试验，结果见表3。
表3 发酵工艺优化Plackett-Burman试验设计结果
Table 3 Results of Plackett-Burman experiments design for fermentation process optimization
用Minitab19.0软件对表2试验数据进行处理，分析各因素的显著性，结果分别见表4和5。由表4和5可知，当以活菌量为响应值时，转速与培养时间有显著影响（P＜0.05）；当以抑菌圈直径为响应值时，转速、装液量与培养时间具有显著影响（P＜0.05）。
表4 以活菌量为响应值Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results using viable bacteria as response value
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
表5 以抑菌圈直径为响应值Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results using inhibition zone diameter as response value
2.3 发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计
将总体满意度值S作为综合响应指标，采用Box-Benhnken试验对发酵条件进行优化，BB试验设计及结果见表6，方差分析结果见表7。
表6 发酵工艺优化Box-Benhnken试验设计结果
Table 6 Results of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization
用Minitab 19.0软件对试验数据进行处理，得到相应的多元拟合回归方程为S=26.253+1.551X1-0.2X2+2.3X3+0.710X12-0.713X22-0.365X32+0.150X1X2-0.692X1X3-0.005X2X3
由表7可知，该回归模型中的F=52.35，P＜0.05，表明该多元回归方程模型效果显著，拟合度较佳。其中X1、X2和X3均对响应值有显著性影响（P＜0.05），XX3的交互作用对响应值有显著性影响（P＜0.05），X1与X2、X2和X3的交互作用均对总体满意度值影响不显著（P＞0.05）。
表7 回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model
注：“***”表示对结果影响极其显著（P＜0.000 01）。
由表7可知，失拟项检验的F=13.45，P=0.07＞0.05，说明该模型拟合程度良好，可以预测发酵工艺最佳条件。由响应面分析预测枯草芽孢杆菌生产的最佳效果为总体满意度为93.95%，最佳发酵工艺条件为摇瓶转速248.75 r/min、装液量74.21 mL/250 mL、培养时间25.31 h。在此优化条件下，发酵液中活菌量对数理论值为8.19，发酵液抑菌圈直径理论值为28.9 mm。
结合实际生产工作情况，调整枯草芽孢杆菌发酵工艺为：摇瓶转速250 r/min、装液量75 mL/250 mL、培养时间25 h。在此工艺条件下进行3次平行验证试验，得到发酵液中活菌量对数实际值为8.03±0.6，抑菌圈直径实际值为（28.2±1.3）mm，分别较优化前提高了1.32倍、1.73倍。结果表明，采用满意度函数-响应面发多枯草芽孢杆菌发酵生产活菌菌体和抑菌物质工艺的优化是可行的。
3 结论
兼顾枯草芽孢杆菌CGMCC5174微生物菌体和发酵液中的抑菌物质两者的生产，避免资源浪费，增加生产效益，降低环境污染。分析了工艺单因素下的最佳生产条件，并结合PB试验、满意度函数分析及响应面分析方法，避免了多个预定指标的相互影响，排除客观噪声污染，这是一种快速、经济、重复性良好的生产试验设计方法。最后，枯草芽孢杆菌CGMCC5174最佳发酵工艺条件为：初始pH值为7.4，装液量75 mL/250 mL，接种量为5.5 mL/100 mL，培养温度37 ℃，转速为250 r/min，培养时间25 h。在此最佳发酵条件下，活菌量对数值为8.03±0.6，抑菌圈直径为（28.2±1.3）mm，分别较优化前提高了1.32倍、1.73倍。
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