随着各个行业的发展,世界对表面活性剂的需求逐年增加。有研究表明,2015-2022年期间,全球表面活性剂销量增长率为5.4%,销售额增长率为5.9%;到2020年,全球表面活性剂市场将达到427亿美元,市场总量将达到2 280.2万t[1]。目前,应用化学表面活性剂较多,但存在环境污染这一潜在问题。绿色、无污染以及高效性表面活性剂成为工业领域的重要发展方向。
表面活性素(surfactin)是一种极具前景的微生物表面活性剂,只需少量剂量就可以使溶液体系界面状态发生明显变化。表面活性素可由多种细菌,真菌和酵母通过非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS)的多酶复合物合成,为两亲性分子[2]。自ARIMA K等[3]首次发现表面活性素后,其结构、合成方式、特性、功能等就不断被发掘。在结构上,由于表面活性素的脂肪酸部分如长度、饱和、分支或羟基化和肽链中氨基酸的类型和序列不固定,可以有多个组合,常以多个同系物的混合形式共存于细胞中[4]。表面活性素具有高发泡能力、低生态毒性、温和的生产条件以及在极端的pH,盐度和温度下具有较高的稳定活性等优点,且具有高度的生物降解性,具有巨大的商业价值[5]。然而,表面活性素的低的生物合成效率和高生产成本限制了其工业化生产。本文综述了表面活性素的生物合成、定量分析、分离纯化技术以及应用来展望其未来的发展,为后期的研究提供参考。
作为一种有效的生物表面活性剂的非核糖体肽,表面活性素并不是纯净物,而是一种可变分子质量同工型的复杂混合物,其基本结构是由手性序列LLDLLDL和C12-19 β-羟基脂肪酸相互连接,形成环状内酯环结构。疏水氨基酸残基位于2、3、4、6和7位,而谷氨酸(glutamic acid,Glu)和天冬氨酸(aspartic acid,Asp)分别在1和5位向分子引入两个负电荷[6]。尽管表面活性素在结构上存在异质性,有多个同系物,但其生物合成模式是一样的。与蛋白质中的多肽链相反,表面活性素不是通过mRNA模板在核糖体上翻译形成的,而是通过以模块方式构建特殊的非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS)形成的。表面活性素的合成主要分为两个部分:前体物质(脂肪酸和氨基酸)的生物合成和表面活性素的组装。
微生物通过摄取相关营养物质(如碳源、氮源等),通过初级代谢(如糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、蛋白质代谢、脂质代谢等)合成前体,在这个过程同时也为后面的表面活性素合成提供能量。随后,NRPS通过多载体巯基化模板机制开始合成表面活性素。NRPS由四个酶亚基组成,分别是酶SrfA(402 kDa),SrfB(401 kDa)和SrfC(144 kDa),SrfD(40 kDa),它们构成7个模块(每个模块主要由腺苷酰化结构域、肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)结构域和缩合结构域3个核心结构域组成),每个模块负责识别、激活和装载单个氨基酸底物[7]。NRPS的N-末端L-Glu活化模块能够结合β-羟基脂肪酸底物并将其连接至起始氨基酸L-Glu,从而启动表面活性素的生物合成,其余氨基酸通过NRPS多酶复合体经过腺苷酰化、缩合反应进行氨基酸的活化和肽链的延伸。表面活性素的生物合成根据多载体巯基化模板机制,组成七肽的所有氨基酸均通过逐步活化和负载单个氨基酸底物来进行。表面活性素起始模块启动后,NRPS装配线从延伸模块C-A-PCP开始[8]:①底物氨基酸和新生肽链通过4'-磷酸泛酰疏基乙胺(4'-phosphopantethein,Ppant)部分被束缚在NRPS上;②A结构域从可用底物库中特异性选择氨基酸,在三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、Mg2+参与下将其激活为氨基酰-一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP);③活化的氨酰基-AMP随后被转移到相邻的PCP上,并作为硫酯与Ppant辅因子结合;④C结构域催化与相邻PCP结构域共价结合的两个中间体之间的肽键形成。但是在模块3和6中发现两个差向异构域(催化与巯基化结构域(thiolation domain,T domain)结合的氨基酸的外消旋作用),分别将左旋-亮氨酸(L-Leu)转化为右旋-亮氨酸(D-Leu)。而在最后一个模块的C-末端存在一个硫酯酶(thioesterase,TE)结构域,负责催化最终的七肽作为大内酯的环化和释放[8]。
表面活性素的前体物质是通过细胞初级代谢获得的,但是,细胞初级代谢产物并不仅仅提供给表面活性素的合成,也会被用于各种细胞生物质的合成,比如细胞膜、酶等。因此,表面活性素的生物合成会于细胞的其他物质合成构成竞争初级代谢产物。由此可见,如果利用基因工程或其他分子技术针对表面活性素的生物合成途径来提高其产量[9],可以通过控制细胞代谢途径或过量表达其相关合成基因,使其获得充足前体物质。如与分泌相关的基因swrC的过表达在枯草芽孢杆菌THY-7中将表面活性素效价提高了约1.5倍,而基因swrC和acrB的过表达在枯草芽孢杆菌168中将表面活性素效价提高了70%[10]。规律间隔成簇短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)介导的氨基酸生物合成分支代谢途径中的16个基因的阻遏导致枯草芽孢杆菌产生多达0.75 g/L表面活性素[11]。
目前,表面活性素主要通过微生物发酵生产,高产菌株的选育是研究的重点和关键,因此,建立筛选模型可以降低表面活性素产生菌筛选的工作量。目前筛选方法大多建立在表面活性素表界面特性基础上。不管是传统的定量分析方法,如酸沉比浊法、油滴扩散法和油滴塌陷法等,还是高通量定量分析方法,如溴百里香酚蓝-氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride-bromothymol blue,CPC-BTB)比色法、聚二乙炔法和高效液相色谱法等都存在其优缺点,因此,常采用两种及两种以上的定量分析方法进行生产菌株的筛选。比如,可以通过乳化试验,液滴崩塌试验,奥西诺尔试验,蓝琼脂试验和原油置换试验来筛选产生生物表面活性剂的细菌[12]。当然,也有些研究是在现有定量分析方法的基础上研发出新的高通量筛选方法,如使用一种新的自动灵敏的荧光检测方法筛选出芽孢杆菌产脂肽菌株[13]。目前几种常见的表面活性素定量分析方法见表1。
表1 表面活性素的定量分析方法
Table 1 Quantitative analysis methods for surfactin
续表
由于表面活性素的回收和浓缩占总生产成本的60%~80%,因此,选择成本更低以及损耗更低的分离纯化方法就显得尤为重要。表面活性素的分离纯化方法常基于其电荷性质,溶解度特性,位置(细胞内、细胞外、细胞结合)以及回收和下游加工的经济性等因素综合选择。表面活性素分离纯化比较传统的方式是酸沉淀,溶剂萃取,结晶,硫酸铵沉淀和离心,泡沫分离,超滤和聚苯乙烯树脂上的吸附-脱附以及离子交换色谱是后面研究比较新颖的分离纯化方法。一般来说,为了获得纯化产物,采用一系列分离纯化步骤进行产物回收的多步回收策略比单一分离纯化步骤更为有效,所以,在很多研究中,会出现多种分离纯化方法交替使用以获得纯度更高的产物,减少损耗。如在提取枯草芽孢杆菌KLP2015中的表面活性素后,通过硫酸铵沉淀,纤维素膜袋透析,二乙氨乙基(diethylaminoethyl,DEAE)-纤维素柱和尺寸排阻色谱法进行纯化,纯化倍数为2.18[26]。在很多研究中,表面活性素的部分纯化基本上会通过酸沉淀和甲醇萃取法联用进行的[27]。表2列举了目前几种常见的表面活性素分离纯化的方法。
表2 常见表面活性素分离纯化方法
Table 2 Isolation and purification methods for surfactin
在食品研发、加工、储藏过程中,除了要注意食品原料、加工工艺、食品包装和保藏方法的选择之外,食品添加剂的选择使用也值得重视。表面活性素是一类最主要的食品添加剂,广泛用于各类食品生产,其用量虽少,但在提高食品质量、改进生产工艺、延长食品保质期,提高生产效率等方面效果显著[35]。表面活性素主要作为食品乳化剂、消泡剂、制糖助剂、清洗剂和水果剥皮剂等出现在食品领域中,其中应用最广泛的是食品乳化剂[36]以及防腐剂[37]。GOMES M ZD V等[38]报道了使用表面活性素去除食物病原体生物膜的方法,发现用0.25%表面活性素进行预处理可将单核细胞增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌的粘附力降低42.0%。
作为一种含有降低表面张力的疏水和亲水部分的两亲性分子,表面活性素具有乳化、洗涤、发泡、增溶、杀菌、润湿、渗透、分散等特性,并具有承受极端环境条件的能力,这有助于疏水成分在产品中的增溶以及通过皮肤屏障的传递[39]。表面活性素这种低刺激性和高皮肤相容性的强大优势是市面上化学表面活性剂所没有的。因此表面活性素在日用品和化妆品领域的使用率很高,成为许多产品配方的重要组成部分,比如洗面奶、润肤乳液、护肤霜、洗发水、护发素、牙膏等。FEI D等[40]报道了表面活性素在洗涤剂配方中作为低毒性和无刺激性的生物表面活性剂的性能。口服毒性试验和皮肤刺激性试验表明,表面活性素适用于商业洗涤剂,同时在乳化性、润湿性、发泡性和稳定性方面也表现出优异的表面和界面特性。
表面活性素是两亲性膜活性肽抗生素,通过其疏水部分与细胞膜相互作用,具有强大的抗微生物、抗炎、抗病毒、抗支原体和抗癌活性,表现出显着的医学应用价值,可作为合成药物和抗菌剂的合适替代品[41]。另外,表面活性素具有抗粘附性能,可抑制生物膜的生成,抑制细菌与感染部位的粘附,为治疗伤口以及皮肤疾病提供了依据[42]。LIU J等[43]的研究结果表明,表面活性素对细菌的粘附和固体表面生物膜的形成具有明显的抑制作用,并直接破坏成熟的生物膜。表面活性素的这种作用可能具有潜在的生物医学应用,特别是在外科手术装置和植入物中。据报道表面活性素(枯草芽孢杆菌产生的环状脂肽)抑制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌或变形杆菌在尿道导管上形成生物膜而不会影响细胞生长,并诱导预先形成的生物膜分散[44]。另外一篇研究中发现了枯草芽孢杆菌AC7产生的脂肽(主要是表面活性素和较低的丰霉素)显著阻止医用级有机硅弹性盘上白色念珠菌的的初始沉积并减缓生物膜的生长,这表明生物表面活性剂涂层在预防与硅酮医疗器械相关的真菌感染方面的潜在作用[45]。装载有表面活性素的聚乙烯醇纳米纤维可改变单核细胞增多性李斯特菌与聚苯乙烯的粘附力,存在表面活性素纳米纤维的情况下,单核细胞增生李斯特氏菌与聚苯乙烯的粘附力显着降低,表明这些纳米纤维可用于伤口敷料或修复装置的涂层中,以防止生物膜形成和继发感染[46]。
表面活性素可减少碳氢化合物-水界面的张力,从而使碳氢化合物假增溶,增加迁移率,达到提高石油采收率的目的[47]。表面活性素还可与油水界面紧密结合,从而形成乳液,这样可以稳定水中的脱附油,并与注入的水一起去除油,这能够用于漏油、清洗油罐中污泥和原油回收[48-49]。市场上生产的绝大多数表面活性素都用于石油相关应用产品,比如页岩抑制剂、酸化缓蚀、脱(除)硫、减阻剂、缓蚀剂、分散剂、防蜡剂、破乳剂、脱硫剂。HADIA N J等[50]评估了枯草芽孢杆菌生物体生产的冻干表面活性素提取物在提高采油率应用中作为化学表面活性剂的替代品的潜力。通过测量两种轻质原油和水相之间的界面张力,发现表面活性素在时其界面张力显着降低。同时,岩心驱油实验表明,通过表面活性素驱油可提高约1.7%~5.0%的采收率。另外一篇研究开发了表面活性素作为一种新型的pH可切换的生物破乳剂,可有效分离油,从废原油中回收超过95%的油[51]。
在农业领域使用化学药品和杀虫剂控制节肢动物通常会产生不良影响,对环境或人类产生不利影响,而表面活性素具有抗菌、抗真菌和杀虫活性的优势,因此表面活性素在农业领域具有不可忽视的应用前景[52-54]。除此之外,表面活性素也可用于获得良好的润湿性并实现肥料在土壤中的均匀分配,或者用作先导化合物以开发新型生物农药[55],或直接用作生物理性产品来控制植物病原性真菌[56-57]。近年来,由于表面活性素其对多种病原体的广泛抗菌活性及其独特的作用方式,可作为常规抗生素的替代品并用于病虫害防治[58]。HUSSAIN T等[59]的研究中发现存在于Bacillus subtilis HussainT-AMU的培养滤液中的表面活性素,对病原体Rhizoctionia solani有非常显著的影响,并观察到块茎产量和植物生长的增加。LI Y等[60]的研究中证明含有表面活性素枯草芽孢杆菌上清液对霜霉病具有很高的活性,并且该活性来自对病原体的直接作用和对植物防御的刺激(防御基因表达的诱导和call的产生)。
毋庸置疑,表面活性素具备着化学表面活性剂所没有的绝对优势,在各个工业领域中有着不可预料的应用潜力。但是,就目前而言,表面活性素的生产上有许多基于实验室的成功,但在工业化生产上还是一个挑战,因为其低生物合成效率以及高下游加工成本还未能使表面活性素大规模生产。表面活性素还有待进一步的探索研究:
(1)表面活性素生物合成模式较为复杂,同系物较多,妨碍了其提高产量、应用以及后期的研究。因此需要对表面活性素的分子结构,细胞内合成机理等进行更深一步的研究,这样才能根据结构性质,更好地应用于各个行业;
(2)表面活性素的生产成本仍然远远高于化学表面活性剂,以至于表面活性素的生产过程在经济上是不可行的。因此,未来将继续加大研究提高产量和回收率的新颖策略(如菌种改良、使用廉价的底物、优化发酵参数、工艺设计和降低下游成本),将实验室层面上的成功过渡到工业层面上,逐渐研发出更多性能优越的新产品,逐渐向专业化、规模化的方向不断发展;
(3)尽管表面活性素在生物医学上具有巨大的潜力,但其应用仍然有限,对其分子作用模式缺乏了解以及对人体有机体的毒性尚不清楚。进一步的研究应探讨表面活性素对人体细胞的影响和毒性,必须进行支持性研究才能证明其在几个生物医学和健康相关领域的潜力。表面活性素的全部潜力被充分开发并应用于医学只是时间问题。
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