脐橙营养丰富，经济价值高。随着我国脐橙资源进一步丰盛，将脐橙加工成为丰富多样的食品，是解决资源过剩的关键[1]。脐橙果酒是兼具脐橙营养物质和酒精的风味饮品，是脐橙资源深加工的重要方向之一[2]。低温发酵是指微生物在相对较低的温度环境中进行发酵，发酵时间延长，而发酵制品风味更佳[3]。果酒中，白葡萄酒是主要的低温发酵产品，低温发酵温度一般为10～12 ℃，具有独特的风味口感[4]。果酒采用低温发酵有如下优点[5]：①降低杂菌微生物对果酒的影响。②较好的保留小分子香气物质。③优化酵母代谢积累产物。研究表明，低温发酵可促进酯类物质生产，并保持果酒中较高含量的萜烯类物质[6]。目前，果酒酿造大多以酒精含量为评价指标，在最适合酒精发酵的条件下发酵。而对果酒的开发研究，越来越注重果酒的香气成分[7]。因此，采用低温发酵工艺酿造脐橙果酒，提高果酒中的香气成分含量，对改善脐橙果酒品质具有重要的意义。
该研究以脐橙为原料，通过单因素试验和响应面试验优化脐橙果酒低温发酵工艺，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，进一步分析脐橙果酒中挥发性风味物质，为低温发酵脐橙果酒的实际生产与应用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脐橙：江西省信丰县；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中国微生物菌种保藏中心；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；果胶酶（酶活5万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；白砂糖（食品级）：郑州瑞之祥生物科技有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：河南华兴生物科技公司；3-辛醇（色谱纯）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
6890N-5975B气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；顶空进样器：美国Supelco公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头：美国Supelco公司；MP2002电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HR1882型榨汁机：飞利浦（中国）投资有限公司；WYT-J型手持糖度计：成都光学厂；pH S22型数显酸度计：德国Sartorius公司；MJX-100B-Z霉菌培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；VS-1300型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 脐橙果酒发酵工艺流程及操作要点
脐橙→分选→清洗→去皮→破碎（加果胶酶）→压榨→果汁（加果胶酶、SO2）→加热→静置→调整成分（接种酵母菌，加白砂糖、SO2）→控温发酵→倒罐→陈酿→脐橙酒
酵母活化：将保藏的菌种接种至YPD液体培养基中活化，于28 ℃振荡培养48 h，放入4 ℃冰箱备用。
脐橙果酒母液的制备：挑选果体偏黄色、色泽均匀、无明显色差、表皮光滑、果形端正的脐橙，剔除霉烂果及杂质。用清水洗涤除去表面污物，以减少原料的带菌量；将脐橙去皮切成小块置于打浆机中破壁。在破壁后的果浆中加入果胶酶100 mg/kg，SO2 50 mg/kg（按偏重亚硫酸钾质量50%计，下同），均匀静置2.5 h后进行榨汁。果汁榨出后再加入果胶酶15 mg/kg，水浴加热至45 ℃，静置澄清4 h，使得果胶充分水解。
脐橙果酒的发酵：将澄清后的果汁分装至250 mL锥形瓶中，添加白砂糖使发酵初始可溶性固形物至一定值，同时加入SO2 30 mg/kg。按体积比接种一定量活化酿酒酵母至含180 mL脐橙果汁的250 mL锥形瓶中。控温发酵，至酒精度稳定不变，视为主发酵结束。发酵过程中定期排出发酵产生的CO2，主发酵结束后倒罐，转入陈酿阶段。将主发酵完成后的酒样置于12 ℃恒温箱陈酿30 d，得脐橙酒。
1.3.2 单因素试验
（1）发酵温度对脐橙果酒低温发酵的影响：初始糖度调整至22%，接种量为果汁体积3%，分别于8 ℃、10 ℃、12 ℃、14 ℃、16 ℃、18 ℃发酵，至可溶性固形物含量不变，测定脐橙果酒的酒精度和总酯含量。
（2）初始糖度对脐橙果酒低温发酵的影响：酵母接种量为3%，于14 ℃发酵，分别添加白砂糖使发酵母液的初始糖含量为19%、20%、21%、22%、23%、24%，至可溶性固形物含量不变，测定脐橙果酒的酒精度和总酯含量。
（3）酵母接种量对脐橙果酒低温发酵的影响：初始糖度为22%，于14 ℃发酵。酵母接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，至可溶性固形物含量不变，测定脐橙果酒的酒精度和总酯含量。
1.3.3 响应面试验
在单因素试验基础上，选取发酵温度（A）、初始糖度（B）、酵母接种量（C）3个因素，以总酯含量（Y）为响应值，进行3因素3水平响应面试验[8]，试验因素与水平见表1。
表1 脐橙果酒低温发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface analysis for navel orange wine low temperature fermentation conditions optimization
1.3.4 测定方法
（1）酒精度、总糖、总酸等基础理化指标的检测参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]；可溶性固形物含量：手持糖度计测定；总酯含量测定：回流皂化法[10]。
（2）感官评定[11]：陈酿阶段完成后进行感官评定。由15名食品专业人员组建感官评定小组，依据感官评分标准（见表2）对果酒进行感官评分，取平均分，满分100分。
表2 脐橙果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of navel orange wine
1.3.5 香气成分检测
顶空-固相微萃取（HS-SPME）[12]：取8 mL脐橙酒样品、3.0 g NaCl于20 mL样品瓶中，密封，将样品瓶于40 ℃搅拌平衡15 min后，将老化的萃取头插入密封的样品瓶中，顶空萃取40 min，然后在气相色谱进样口230 ℃解吸3 min，采用GC-MS分析其挥发性成分。
GC条件：石英毛细管色谱柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始温度40 ℃，保留时间2 min，以5 ℃/min升至230℃，保留时间15min；不分流进样，载气He，流速：1.2mL/min。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，进样口温度250 ℃，传输线温度250 ℃，质量范围33～400 amu。
定性与定量分析：与Wiley7.0/美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）05检索数据库进行匹配，并结合保留指数进行定性分析。采用峰面积归一化法计算各物质的相对含量。
1.3.6 数据分析
数据采用SPSS18.0进行统计分析，Design-Expert V8.0.6进行响应面试验，Origin2018作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 发酵温度对脐橙果酒发酵的影响
图1 发酵温度对脐橙果酒酒精度和总酯含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and total ester content of navel orange wine
由图1可知，随发酵温度的增加，酒精度呈现逐渐上升的趋势，而总酯含量呈现先增加后缓慢下降的趋势。当脐橙果酒发酵温度为14 ℃，总酯含量达到最大值（1.081 g/L）。发酵温度过低时，会导致发酵迟滞或停止[13]，严重影响发酵效果，酒精度和总酯含量偏低。发酵温度偏高则不利于小分子的保留，使果酒总酯含量略低。综合考虑，发酵温度为14 ℃较合适。
2.1.2 初始糖度对脐橙果酒发酵的影响
图2 初始糖度对脐橙果酒酒精度和总酯含量的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on alcohol content and total ester content of navel orange wine
由图2可知，随初始糖度的增加，酒精度和总酯含量呈现先上升后下降的趋势，在初始糖度为22%时达到最大值（1.128 g/L）。发酵母液中的糖是酵母代谢产生酒精和风味物质的主要消耗物，母液中的糖含量过低，则果酒无法达到预期的酒精度，口味寡淡。发酵母液中的糖含量过高，则会使酵母处于高渗环境中，抑制酵母的发酵效率，果酒口感也会变差[14]。综合考虑，初始糖度为22%较合适。
2.1.3 接种量对脐橙果酒发酵的影响
图3 酵母接种量对脐橙果酒酒精度和总酯含量的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on alcohol content and total ester content of navel orange wine
由图3可知，脐橙果酒的酒精度与总酯含量随酵母接种量的增加呈现先增大后减小的趋势，在接种量为3%时达到最大值（1.080 g/L），果酒的发酵接种量的大小受到菌种和发酵母液的环境的限制，直接影响到果酒的发酵效率[15]。低温发酵时接种量过小，则启动发酵较慢，发酵效率低。接种量过高则会导致营养物质消耗量过大，不利于酒精和酯类物质的生产。综合考虑，选择接种量为3%较合适。
2.2 响应面试验结果分析
在单因素试验基础上，确定发酵温度（A）、初始糖度（B）、酵母接种量（C）为考察因素，以总酯含量（Y）为响应值，由Design-Expert V8.0.6统计分析软件设计3因素3水平Box-Behnken响应面试验，响应面分析结果见表3，方差分析见表4。通过软件分析拟合，得到脐橙低温发酵果酒总酯含量对发酵温度（A）、初始糖度（B）、酵母接种量（C）的回归方程为：Y=1.074+0.020A+0.052B+0.024C-0.03AB-0.049AC+0.03BC-0.11A2-0.09B2-0.07C2。
表3 脐橙果酒低温发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for navel orangewinelowtemperaturefermentationconditionsoptimization
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），回归模型的决定系数R2=0.985 4，调整决定系数R2Adj=0.966 6，说明该回归模型与试验拟合较好，可以用于对低温发酵脐橙酒总酯含量的预测。其中B、C、AC、A2、B2、C2对果酒总酯含量影响极显著（P＜0.01）；A、AB、BC对结果影响显著（P＜0.05）。由方差分析说明试验所选因素的影响强弱次序为初始糖度＞酵母接种量＞发酵温度。
由响应面分析得到低温发酵脐橙酒的最佳条件为发酵温度13.98 ℃，初始糖度22.33%，酵母接种量3.24%，理论预测总酯含量为1.086 g/L。考虑实际因素及操作条件，将低温发酵脐橙酒的工艺参数调整为发酵温度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接种量3.2%，据此工艺条件的低温发酵试验，经3次验证试验得到果酒的平均总酯含量实际值为1.084 g/L，与预测值接近，说明模型可行性较高，可作为实际生产的依据。
图4 初始糖度、发酵温度、酵母接种量交互作用对总酯含量影响的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar content,fermentation temperature and yeast inoculum on total ester content
2.3 脐橙低温发酵酒理化指标及香气成分分析
表5 低温发酵脐橙果酒基本理化指标
Table 5 Basic physicochemical indexes of low temperature fermented navel orange wine
由表5可知，脐橙果酒各项理化指标符合国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》标准。
对低温发酵脐橙果酒的香气成分进行的定性与定量分析结果（见表6）可知，脐橙果酒共鉴定出33种香气化合物，含量占总成分的97.91%，其中醇类物质6种（17.09%），萜烯类物质10种（27.65%），酸类物质2种（8.03%），酯类物质10种（43.24%），醛酮类物质5种（1.91%）。香气成分分析结果表明，酸类和醛酮类物质整体较少，萜烯类、酯类和醇类物质相对含量较高。低温发酵的相关研究表明，低温环境为萜烯类和酯类物质提供了较好保留环境[16]。与此同时，酵母处于低温胁迫状态时，也会减少高级醇含量，并使酯类物质产量增加[17]。
在萜烯类物质中含量相对较高的有D-柠檬烯（14.70%）、β-水芹烯（5.38%）、4-萜烯醇（3.52%），这些物质主要是脐橙的原果香气，赋予果酒独特的脐橙风味与口感[18]。尤其是D-柠檬烯，在果酒中含量高，香气阈值低，对果酒香气贡献较大，此外，研究还发现其具有独特的保健功能[19]；酯类物质含量相对较高的有辛酸乙酯（10.68%）、癸酸乙酯（8.87%）、庚酸乙酯（7.77%），这些物质对于果酒的花香、果香具有较大的贡献[20]，在低温发酵时产量较高。
醇类物质与酸类物质含量均与酵母低温发酵代谢有关，低温发酵会使高级醇含量减少，而癸酸和辛酸是酵母低温发酵典型的代谢产物，与酵母的低温适应性有关。醛酮类物质整体含量较低，对果酒的影响较小。
表6 低温发酵脐橙果酒香气成分分析
Table 6 Analysis of aroma components in low temperature fermented navel orange wine
3 结论
本研究通过单因素及响应面试验优化脐橙果酒低温发酵工艺，最佳发酵条件为发酵温度14 ℃、初始糖度22.3%、酵母接种量3.2%。在此最佳发酵条件下，酿造的脐橙果酒总酯含量为1.084 g/L。此工艺酿制的脐橙果酒外观澄清、透明，果香酒香浓郁协调，具有独特的风味。通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对脐橙酒风味物质进行分析鉴定，在低温发酵脐橙酒中共检出挥发性风味物质32种，其中含量较高的为萜烯类物质（28%）和酯类物质（43%），两类物质对于果酒的香气具有重要贡献。试验对丰富脐橙果酒香气成分，改善脐橙果酒品质具有重要意义。
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