在我国，啤酒行业存在生产成本高、产品种类单一、缺乏特色与创新等问题[1]，在保证产品质量的情况下降低生产成本以保证效益，同时推出更多风格的产品，加大市场竞争力，是啤酒企业亟需解决的问题。啤酒高浓酿造技术（指用15°P以上的麦汁酿造啤酒的工艺）具有诸多优点，它可减少生产成本、降低能源消耗、缩短生产周期[2-4]。同时，高浓酿造技术还有助于提高啤酒的非生物稳定性，促使冷浑浊蛋白的沉淀，对啤酒风味具有改善作用，发酵后的高酒精度有利于抑制杂菌生长，提高单位浸出物的酒精产率等[5]。此外，由于其独特的酿造工艺，已被广泛应用于淡爽型啤酒的酿造[6-7]。
然而，啤酒高浓酿造技术存在一些弊端[8]：延长了啤酒发酵时间，酵母的活力与存活率下降；啤酒风味稳定性变差，高浓酿造的啤酒与常浓酿造的啤酒风味存在差异，采用该技术常导致啤酒醇酯不协调；啤酒泡沫稳定性变差，啤酒的泡持性降低；酒花利用率降低。此外，酵母细胞在高浓酿造过程中往往面临更严峻的环境胁迫，主要来自两方面[9]：一方面，发酵初期更高的麦汁浓度导致麦汁体系渗透压更高，不利于酵母的生长；另一方面，发酵结束时乙醇浓度更高，导致细胞面临更强的毒性，致使酵母存活率下降，活细胞数减少，不利于酵母的重复使用。酵母可调控自身代谢以适应环境变化，但当环境过于苛刻，或超出酵母适应范围，会对酵母的发酵性能以及生理特性等造成不利的影响[10]。
高浓麦汁中补充营养物质是一种行之有效的方法。在高浓麦汁中添加氮源、麦角固醇以及油酸时，可促进酵母生长、提高乙醇产量，发酵结束时活细胞率仍保持在较高水平[11]。添加S-腺苷甲硫氨酸可提高巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）在高浓酿造过程中的发酵速率[1]。在麦汁中直接添加氨基酸、肽、蛋白水解物或蛋白酶，也可提高酵母在高浓酿造过程中的发酵性能：乙醇对细胞的生长具有抑制作用，但添加精氨酸可以大大减轻乙醇损伤，相反，当胞内精氨酸含量减少时，酵母细胞对乙醇浓度更敏感[12]。
红枣（Ziziphus jujuba Mill）是鼠李科属植物枣树的成熟果实，营养丰富，药用价值高，富含蛋白质、脂肪、多糖、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及钙、磷、铁等成分，其中维生素C的含量在果品中名列前茅，有“天然维生素丸”之美称。我国是世界上最大的红枣生产国，同时也是最大的红枣及其加工品出口国，全球90%以上的红枣都由我国供应，市场占有率高。2018年全国红枣年产量高达883多万吨，占世界总产量的1/3。在人们生活水平不断提高的当今社会，随着保健食品行业的快速兴起，红枣以其丰富的营养价值及多种保健功能成为人们关注的焦点[13]。
本研究以红枣作为营养补充剂，通过制备红枣汁，将红枣汁添加到高浓麦汁中进行啤酒发酵，分析其对高浓酿造过程中酵母发酵性能及啤酒风味的影响。研究结果对啤酒高浓酿造工业生产中通过营养物调控酵母发酵性能的实践研究具有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）BF16：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 原料与试剂
陕北木枣：采于榆林市清涧县；青岛纯生啤酒：市售；大麦芽：厦门市老啤匠贸易有限公司；酒花颗粒：西安雪花啤酒有限公司；麦芽糖浆：湖北千凤香食品有限公司；2-辛醇（色谱纯）：范德（北京）生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
R-100旋转蒸发仪：瑞士步琦有限公司；WGL-230B烘箱：上海精宏实验设备有限公司；CM-5色差计：科电贸易（上海）有限公司；LRH-250CL低温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PAL-1数字手持折射仪：日本ATAGO（爱宕）公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；GL-10MD高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；DMA 35安东帕便携式密度计：奥地利安东帕有限公司；GCMSQP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 高浓麦汁的制备
称取一定量的大麦芽，粉碎并过筛，以料液比1∶4（g∶mL）加入45 ℃蒸馏水，搅拌并开始糖化，糖化程序如下：在45 ℃下保温30 min；升温至63 ℃并保温60 min；再升温至72 ℃并保温10 min；最后将温度升至78 ℃，保温10 min。均以1 ℃/min的速率升温。
糖化结束后，将麦汁迅速冷却至45 ℃后过滤，将滤液再次加温至沸腾，保持沸腾状态90 min。在麦汁沸腾后，分3次添加酒花颗粒[14]，添加量为麦芽质量的0.2%。
煮沸完成后，将麦汁再次过滤，使用蒸馏水调整麦汁浓度至常浓（12°P）。向常浓麦汁中加入麦芽糖浆，调整浓度至24°P，并分装至2 L的锥形瓶中。将所得高浓麦汁进行高压灭菌（121 ℃，15 min）。
1.3.2 红枣汁制备
称取一定量的红枣，洗净后加入一定量温水浸泡10min，破碎后于45 ℃下浸提4 h，料液比为1∶4（g∶mL）。浸提完成后，将枣汁进行过滤。使用旋转蒸发仪将所得枣汁进行浓缩，调整红枣汁糖度与高浓麦汁一致，将枣汁进行巴氏杀菌（80 ℃，10 min），备用，高浓麦汁和高浓红枣汁的氨基酸组成见表1。
表1 高浓麦汁和高浓红枣汁的氨基酸组成
Table 1 Composition of amino acids in high gravity wort and jujube juice
注：数值是三次平行实验的平均值，标准偏差均低于平均值的10%。“*”表示必需氨基酸。
1.3.3 接种酵母及啤酒发酵
分别添加10%、15%、20%、25%、30%、35%的红枣汁于高浓麦汁中。对麦汁进行高温灭菌（121 ℃，15 min）。以2 g/L的接种量接种酵母。无菌条件下，先以少量麦汁将活性干酵母活化（37 ℃，30 min），之后将酵母转移至锥形瓶中，开始发酵。接种酵母后，将锥形瓶转移至低温培养箱中，于12 ℃下进行发酵。发酵期间，每日摇瓶称质量。当发酵结束后，将发酵液离心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），离心所得酵母泥用于酵母计数及测定活细胞率，上清液保存于4 ℃冰箱备用。
1.3.4 分析检测
（1）发酵度测定
使用附温比重瓶对发酵后的麦汁浓度进行测定：将比重瓶洗净烘干至恒质量，将蒸馏水或离心所得上清液缓慢倒入比重瓶中，避免产生气泡。使之升温至20 ℃并准确称量其在该温度下的质量，计算得到麦汁与蒸馏水的质量比。根据比重与浸出物质量百分含量对照表查得20 ℃下麦汁中浸出物含量，并以°P表示。发酵度计算公式如下：
（2）酒精度测定
使用密度计直接对酒精度进行测定：取离心后上清液与蒸馏水各50 mL，加入蒸馏烧瓶中进行蒸馏，准确收集馏出液50 mL，用仪器直接吸取馏出液并读数，酒精度单位以体积分数%vol表示。
（3）风味物质测定
采用气相色谱-质谱联用法，与常婷婷等[15]相同的条件进行分析：在20 mL顶空瓶中加入6 mL样品、1.5 g NaCl以及20 mg/mL的2-辛醇标准溶液20 μL，此时样品中2-辛醇实际质量浓度为66.7 μg/mL，加盖密封后进行测定分析。未知化合物经计算机检索同时与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wileylibrary数据库相匹配，保留指数＞85的结果，所得风味物质为相对于内标的含量。
色谱条件：色谱柱为DB-1 ms毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱温40 ℃；进样口温度230 ℃；程序升温：40℃保持3min，然后以4℃/min速度升至120 ℃，再以6 ℃/min升至240℃，保持9min；载气为高纯氦气（He），流速1.0mL/min；不分流进样。
质谱条件：离子源温度为230 ℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70eV，质量扫描范围35～400amu。
（4）色值测定
使用色差仪对啤酒的色值进行测定。以商品啤酒青岛纯生作为对照，根据发酵得到啤酒的酒精度，按不同比例将之稀释至与青岛纯生相同的酒精度（3.3%vol）。使用蒸馏水对色差仪进行调零，测定所有样品与青岛纯生的L*值、a*值、b*值，计算总色差，其计算公式如下：
式中：ΔE为总色差；ΔL*为明度差；Δa*为红绿色差；Δb*为黄蓝色差。
1.3.5 数据分析
各数据均为3次测定的平均值，采用Minitab 18（Minitab Inc.）进行数据分析，采用Fisher最小显著差数（least significant difference，LSD）法进行显著性分析。其中，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。使用Excel 2019作图。
2 结果与分析
2.1 添加红枣汁对高浓酿造过程中CO2质量损失的影响
添加不同比例红枣汁进行啤酒发酵的过程中，CO2质量损失情况见图1。由图1可知，接种酵母后的第1天，各组CO2质量损失均较少。从第2天开始CO2质量损失迅速增加，单日质量损失量达到峰值。其中添加15%红枣汁组最高单日CO2质量损失达9.8 g/L。随后增速减缓，曲线趋于平稳。发酵结束时，对照组总CO2质量损失为92.6 g/L，添加15%红枣汁组总CO2质量损失为95.2 g/L，添加25%红枣汁组最低为92.6 g/L。
图1 发酵期间各组CO2质量损失
Fig.1 CO2 mass loss of each group during the fermentation
在发酵前期（发酵开始至第5天），添加不同比例红枣汁的样品组总CO2质量损失均高于对照组；发酵中期（6～12 d），对照组总CO2质量损失反超各红枣汁添加组；发酵临近结束时（13～14 d），所有添加红枣汁的样品组总CO2质量损失再次超过对照组。这可能是由于发酵前期麦汁体系的渗透压较高，添加红枣汁提高了酵母细胞对高渗透压的耐受性，因此在发酵前期酵母的活性更强，表现出更高的发酵能力，酵母细胞可以快速消耗利用各种营养物质进行生长繁殖与发酵，产生大量的代谢物，如乙醇等[16-17]。与麦汁相比，红枣汁富含脯氨酸（表1），已有研究表明，脯氨酸可参与酵母提高自身耐受性的分子机制，保持胞内蛋白和质膜的稳定性、降低脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的熔解温度（Tm）值、清除活性氧自由基等[18]。
2.2 添加红枣汁对麦汁发酵度和乙醇产量的影响
发酵度反映了酵母对糖的消耗利用程度，各组发酵度结果见图2。由图2可知，添加不同比例的红枣汁均能显著提高发酵度（P＜0.01），其中对照组发酵度最低，为84.66%；30%红枣汁组发酵度最高，为88.18%，其次是35%红枣汁组，发酵度达87.90%。在本试验红枣汁添加范围内（10%～35%），发酵度由高到低可分为四组：30%、35%＞20%、25%、15%＞10%＞对照（组内不存在显著差异）。结果表明，红枣汁添加量越高，最终的发酵度也越高。
各组乙醇产量结果见图3。由图3可知，添加不同比例的红枣汁均能一定程度提高乙醇产量，其中，对照组酒精度为10.80%vol。15%、35%红枣汁组显著高于对照组（P＜0.05），30%红枣汁组酒精度达11.30%vol，极显著高于对照组（P＜0.01）。
图2 添加红枣汁对麦汁发酵度的影响
Fig.2 Effect of jujube juice supplementation on wort fermentation degree
“*”表示与对照组差异显著（P＜0.05）；“**”表示与对照组差异极显著（P＜0.01）。下同。
图3 添加红枣汁对乙醇产量的影响
Fig.3 Effect of jujube juice supplementation on ethanol production
本研究结果与文献[19]报道结果类似，可能是由于相较于麦汁中较为单一的营养组成，红枣汁的成分更为复杂多样，其中的高含量脯氨酸有助于提高酵母细胞在高浓环境下的活力，促进细胞对糖的利用与转化，使细胞能够在更高的乙醇浓度下依然保持提高乙醇产量，并且对高乙醇浓度具有更高的耐受性。
2.3 添加红枣汁对啤酒色值的影响
颜色是啤酒重要的感官指标之一，啤酒的颜色给消费者的第一印象是消费者选择啤酒时的重要依据。通常用EBC值来反映啤酒的色度，国标GB 4927—2008《啤酒》中规定，色度2～14 EBC的为淡色啤酒，15～40 EBC为浓色啤酒，41 EBC以上为黑色啤酒。但是EBC比色法需要实验人员肉眼观察，人为因素导致的误差更大。采用国际照明委员会（commission internationale de l'Eclairage，CIE）的Lab颜色体系，对啤酒的色值进行表示与分析。不同红枣汁添加量对啤酒色值的影响见表2。
对照组及各样品组均与青岛纯生进行比较。由表1可知，各组在L*值、a*值、b*值上均与青岛纯生啤酒存在显著差异（P＜0.05），其中对照组与青岛纯生之间的差异最小。随着红枣汁添加比例越高，啤酒的L*值降低，a*值升高，b*值升高，总色差（ΔE）值越大。35%红枣汁组亮度最低，a*值与b*值最高，与青岛纯生及对照组的差异最大。
表2 红枣汁添加量对啤酒色值的影响
Table 2 Effect of jujube juice supplementation on beer color value
注：同一列中不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
在Lab颜色体系中，L*值表示亮度，a*值由负到正表示由绿到红，b*值由负到正表示由蓝到黄，即红枣汁的添加导致啤酒的亮度下降，并呈现出更多的红色与黄色。这是由于红枣汁中含有丰富的色素，当红枣汁的添加比例增加时，溶解到啤酒中的色素也越多，因此啤酒的色值与红枣汁的添加量同步变化。
2.4 添加红枣汁对啤酒风味物质的影响
添加不同比例的红枣汁对啤酒风味的影响见表3。由表3可知，在7个组中一共检测到50种挥发性风味物质，包括10种醇类物质、33种酯类物质和7种酸类物质，其中以醇类、酯类物质含量最高。在所有样品中风味物质含量较高的有：异戊醇、活性戊醇、苯乙醇三种醇类物质，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙基9-癸烯酸酯、癸酸乙酯六种酯类物质。在对照组中，醇类及酯类物质含量占风味物质总量的94.1%。添加红枣汁导致啤酒的醇酯比有所降低，这是由于总醇的含量降幅大于总酯含量降幅，其中主要是异戊醇、活性戊醇等高级醇含量降低。高级醇是大多数风味酯的前体物质，并且高级醇的产生与蛋白质的合成之间有着密切的联系，它是氨基酸分解代谢的副产物。而细胞对乙酸酯类的合成则主要由醇乙酰基转移酶催化一分子高级醇（或乙醇）和一分子活化的乙酰辅酶A形成。添加红枣汁导致啤酒异戊醇含量仅为对照组的69.3%～77.9%，活性戊醇含量为对照组的68.8%～74.8%。对照组表现在最高的醇酯比，为1.01，而添加20%和25%红枣汁的啤酒表现出了最低的醇酯比，均为0.87。高级醇是导致啤酒“上头”的主要原因[20]，因此，高级醇含量的降低可以减轻饮用啤酒对身体造成的不适，有益身体健康。结果表明，添加红枣汁进行发酵的啤酒表现出较强的酯香味，而且口感均衡。
表3 添加红枣汁对啤酒风味物质组成的影响
Table 3 Effect of jujube juice supplementation on the composition of beer flavor substance
续表
注：高浓酿造风味物质含量数值统一折算成乙醇体积分数在5%条件下所对应的数值，数值是三次平行实验的平均值，标准偏差均低于平均值的10%；“-”表示未检出。
3 结论
在啤酒高浓酿造过程中添加红枣汁，可以提高发酵初期的发酵速率，更快的发酵速度能缩短发酵周期。添加红枣汁能够提高发酵结束时的麦汁发酵度及乙醇产量，其中，30%的红枣汁添加量效果最好，发酵度及乙醇产量分别比对照组提高了4.16%和4.63%。添加红枣汁可改变啤酒的颜色：L*值降低，a*值与b*值升高，即降低啤酒的亮度，并使啤酒呈现出更多的黄色与红色，即表现出更多与红枣相似的感官特性。红枣汁的添加可有效降低啤酒醇酯比，使啤酒的口感更加均衡与柔和。
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