黑虎香葡萄属鲜食、制汁和酿酒兼用品种。自20世纪90年代引入烟台之后，在雨热同季气候条件下，易管、丰产、抗病、抗冻。单品种酿造葡萄酒果香浓郁，口感柔顺，清爽平衡，新鲜易饮，具有较大的酿酒开发潜力[1]。
脱落酸（abscisic acid，ABA）是一类重要的内源植物激素，参与促进呼吸跃变型和非呼吸跃变型果实的成熟[2-3]，在葡萄果实成熟过程中能够促进果实着色、增糖降酸和果实软化[4-10]。近年来对鲜食和酿酒葡萄研究发现，外源ABA处理可以促进葡萄果实酚类物质积累，促进果实着色[11-12]，增加香气物质的种类和含量，改善酿酒葡萄及葡萄酒的品质[13]。
DAVIES C等[14]研究认为，ABA能够促进果实着色，提高果实品质，但对于不同树种和品种的作用浓度、作用时间仍需进行系统的试验，针对不同品种特性确定出不同方案。虽然黑虎香栽培表现良好，但由于生长季短，果实采收时相对常规酿酒葡萄品种颜色较浅，酸高糖低。因此对黑虎香葡萄转色期喷施不同浓度ABA，探明外源ABA对黑虎香葡萄酒品质的影响，筛选最佳处理浓度，为配套黑虎香优质栽培技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑虎香：2013年定植于山东省烟台市牟平区姜各庄镇大庄村，自根苗，南北行向，株、行距4.0 m×3.5 m，架式为飞鸟架，新梢间距为13 cm，土壤类型为沙壤土，常规管理。
焦亚硫酸钾（分析纯）、商业酿酒酵母ADT：上海鼎唐国际贸易有限公司；ABA（分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；2-辛醇（纯度＞98%）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；L3S可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ离心机：中国安科控股有限公司；GCMS-QP2010ULtra气质联用仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
于葡萄转色期（2018年9月18日）用ABA均匀喷淋果实，设置3个质量浓度：25 mg/L、100 mg/L和500 mg/L，用清水作对照，每个浓度处理10株，3次重复。于成熟期（2018年10月24日）采收。果实采收后除梗破碎，置于5 L玻璃罐中，添加焦亚硫酸钾0.12 g/L、商业酿酒酵母ADT 0.3 g/L，于20～25 ℃进行小容器发酵10 d，酒液比重达0.997以下并保持不变后，汁渣分离，将自流酒和压榨酒混合，酒液澄清后取上清进行满瓶陈酿，陈酿3个月后进行品质测定。
1.3.2 基本理化指标测定
还原糖：斐林试剂滴定法（以葡萄糖计）[15]；可滴定酸：电位滴定法（以酒石酸计）；pH值：PHS-3C pH计测定；酒精度：比色法[16]；干浸出物：密度瓶法[15]；pH示差法[17]、福林丹尼斯法[18]、福林酚法[19]依次测定花色苷、单宁、总酚含量，每个样品平行测定3次。
1.3.3 挥发性香气成分测定
取5 mL葡萄酒样品置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL质量浓度为50 μg/mL的2-辛醇作内标，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。采集数据后经MS-DIAL program3.40软件解卷积处理并计算保留指数，得到各保留时间的化合物名称，峰面积及保留指数，以2-辛醇为内标，对挥发性香气成分定量分析。
气相色谱-质谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：45 ℃保持1 min，以6.0 ℃/min升温至230 ℃，保持4 min，进样口温度250 ℃，高纯氦气流速1.0mL/min。质谱接口温度250℃，电子电离（electronionization，EI）源，电子能量70 eV，检测器电压1 000 V。
1.3.4 数据分析
数据处理采用Excel 2010，用SPSS 19.0进行单因素方差分析（P＜0.05），采用MetaboAnalyst 4.0进行偏最小二乘法-判别分析（partial least square-discriminat analysis，PLS-DA）。
2 结果与分析
2.1 不同浓度ABA喷施果实对黑虎香葡萄酒基本理化指标的影响
浸出物含量的多少决定葡萄酒的主体骨架，充足的干浸出物使酒质圆滑，而干浸出物低的葡萄酒则口感淡薄[20]。由表1可知，100 mg/L、500 mg/L ABA处理葡萄酒酒精度均显著提高（P＜0.05），500 mg/L ABA处理酒精度比对照组提高12.1%；残糖含量无显著差异（P＞0.05）；总酸含量均显著降低（P＜0.05），25 mg/L ABA处理总酸含量降低15.5%；25 mg/L ABA处理干浸出物含量显著低于对照（P＜0.05），100 mg/L ABA处理、500 mg/L ABA处理干浸出物含量分别比对照增加32.8%、33.4%，显著提升了葡萄酒口感。与权桂蓉等[13]用100 mg/L ABA在赤霞珠葡萄上研究结果一致。
表1 不同处理黑虎香葡萄酒基本理化指标
Table 1 Basic physiochemical indexes of Heihuxiang wine with different treatments
注：数值后的不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
葡萄酒的酒精度和酸主要来源于葡萄果实的糖和酸。本试验结果表明，ABA处理增加了成熟期葡萄含糖量，降低酸含量。与前人在巨峰、红提、赤霞珠和蛇龙珠[21-24]等的研究结果一致，可能是因为外源ABA调节ATPase 酶活性，促进浆果内糖分的卸载，提高转化酶的活性，最终提高浆果内糖分的含量[21，25]。同时，ABA是葡萄重要的成熟启动因子，当ABA含量积累到一定程度时就会开始对葡萄果实的成熟衰老进行调控[26]，外源ABA处理能通过上调ABA的基因转录表达来促进水果的软化、成熟和衰老[27-28]。
2.2 不同浓度ABA喷施对黑虎香葡萄酒酚类物质含量的影响
表2 不同处理黑虎香葡萄酒酚类物质含量
Table 2 Phenolic content of Heihuxiang wine with different treatments
酚类物质种类和含量决定了葡萄酒的色泽、口感和陈酿潜力，而葡萄酒酚类物质主要来自葡萄果实。因此，增加葡萄果实中酚类物质含量对于以优质葡萄酒生产为目标的葡萄栽培和相应的酿造工艺的确定都有重要的参考价值。黑虎香相对传统酿酒葡萄品种而言，其葡萄酒中花色苷含量偏低，由表2可知，果实喷施外源ABA显著增加了葡萄酒中花色苷和总酚的含量，随着喷施浓度的增加，花色苷含量分别为对照组的2.1倍、2.0倍和2.4倍，总酚含量分别比对照组提高4%、9.9%和17.9%。有研究人员认为ABA促进着色的主要原因是ABA上调了花色苷合成途径关键酶基因VvCHI、VvF3H、VvDFR、VvLDOX、VvUFGT和转录因子VvmybA1的表达，显著增加酚类物质的含量[29-33]，促进果实成熟和着色，进而提升葡萄酒颜色和口感。本实验中单宁的变化规律与花色苷和总酚不同，只有500 mg/L ABA处理下显著增加（P＜0.05），25 mg/L和100 mg/L ABA处理与对照葡萄酒单宁含量无显著差异（P＞0.05），这与前人研究结果一致[34-36]。
2.3 不同浓度ABA喷施对黑虎香葡萄酒挥发性香气的影响
挥发性香气成分是衡量葡萄酒品质的重要指标，其种类、含量、阈值及其之间的相互作用共同构成了葡萄酒香气的风格特征和典型性。由表3可知，喷施ABA未增加黑虎香葡萄酒中挥发性香气成份种类，处理和对照黑虎香葡萄酒均检测出62种挥发性香气成分，其中包括30种酯类，7种醇类，7种酮类，8种醛类和10种萜烯类。酯类以乙酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯为主，醇类以苯乙醇、壬醇和正己醇为主，酮类以香叶基丙酮和2,3-戊二酮为主，醛类和萜烯类分别以乙缩醛二乙醇和里那醇为主。
表3 不同浓度脱落酸处理黑虎香葡萄酒挥发性香气成分
Table 3 Aroma components of Heihuxiang wine with different concentrations of abscisic acid
续表
ABA处理降低黑虎香葡萄酒酯类比例，增加醇、醛、酮、萜烯类比例，且随处理浓度增加，酯类比例分别降低8.1%、12.5%和12.3%，醇类比例分别增加40.3%、30.4%和29.9%，酮类比例分别增加27.9%、43.7%和72.1%，醛类比例分别增加7.3%、86.0%和82.3%，萜烯类比例分别增加48.6%、15.5%和25.3%。
2.4 外源ABA喷施果实对挥发性香气成分的影响程度
以检测到的酯类、醇类、酮类、醛类和萜烯类组分含量为变量，分别进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。从图1a～图1e可以看出，喷施外源ABA对黑虎香葡萄酒香气成分影响较大的包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、壬醇、戊二酮、香叶基丙酮、乙缩醛、香茅醇和香叶醇，得分均大于1。除25 mg/L ABA处理情况下乙酸乙酯含量最高外，其他成分均以500 mg/L ABA处理组葡萄酒中的含量最高。对上述成分含量进行显著性分析（表3）发现，500 mg/L ABA处理下除了乙酸乙酯含量显著低于对照组外（P＜0.05），其余成分均显著高于对照组（P＜0.05）。其中乙酸苯乙酯、苯乙醇、壬醇、戊二酮、香叶基丙酮、乙缩醛、香茅醇和香叶醇含量分别提高100.5%、27.8%、68.1%、170.5%、116.7%、91.8%、76.7%和78.0%。
葡萄酒香气成分按来源可分为三类：品种香气、发酵香气和陈酿香气[37]。本试验中，在品种、发酵和陈酿条件一定的情况下，葡萄酒香气成分的差别主要来源于采收期葡萄果实品质的差异。而影响葡萄香气成分主要因素为品种、栽培技术、成熟度、生长条件等，其中成熟度对香气影响最大[38]，而外源ABA主要作用是加快葡萄成熟，这可能是本试验中不同浓度ABA处理下葡萄酒香气成分含量发生变化的主要原因。有学者研究表明，转色期用500 mg/L ABA浸蘸巨玫瑰果实，能使葡萄提早10 d成熟，葡萄果实中的萜烯类香气成分一般认为从果实转色后开始积累，到果实成熟迅速增高[39-40]。本试验中ABA处理提高了葡萄酒中萜烯类成分含量，可能是因为ABA处理使葡萄果实提前成熟，进而使萜烯类物质含量提高。处理组葡萄酒酯类含量降低，可能由于黑虎香葡萄果实中酯类随着成熟度增加而损失，或者在发酵过程中酵母发酵产生酯类所需的底物含量随葡萄成熟度的增加而降低引起。
图1 酯类（a）、醇类（b）、酮类（c）、醛类（d）和萜烯类（e）组分含量为变量进行的偏最小二乘法-判别分析
Fig.1 Partial least squares-discrimination analysis with the content of esters (a),alcohols (b),ketones (c),aldehydes (d) and terpenes (e) as variables
A、B、C、D分别代表对照、25 mg/L ABA处理、100 mg/L ABA处理、500 mg/L ABA处理。
3 结论
结果表明，转色期果实喷施500 mg/L ABA可以显著提高黑虎香葡萄酒酒精度、干浸物、花色苷和总酚含量，降低酸含量，使葡萄酒口感圆润、颜色加深、保健作用增强。显著增加萜烯类、醇类和醛酮类物质含量，提升葡萄酒香气质量。但在同样的栽培条件下，喷施ABA之后黑虎香适宜采收时间的确定，以及对果实风味物质影响机理有待进一步研究。
[1]肖慧琳，王安妮，张超杰，等.烟台产区‘黑虎香’品种特性初探[J].烟台果树，2018（2）：32-34.
[2]ZHANG Y J,WANG X J,WU J X,et al.Comparative transcriptome analyses between a spontaneous late-ripening sweet orange mutant and its wild type suggest the functions of ABA,sucrose and JA during citrus fruit ripening[J].PLoS One,2014,9(12):e116056.
[3]SUN Y,CHEN P,DUAN C,et al.Transcriptional regulation of genes enzymes of abscisic acid metabolism during melon (Cucumis melo L.) fruit development and ripening[J].J Plant Growth Regulat,2013,32(2):233-244.
[4]YU X C,LI M J,GAO G F,et al.Abscisic acid stimulates a calcium-dependent protein kinase in grape berry[J].Plant Physiol,2006,140:558-579.
[5]WHEELER S,LOVEYS B,FORD C,et al.The relationship between the expression of abscisic acid biosynthesis genes,accumulation of abscisic acid and the promotion of Vitis vinifera L.berry ripening by abscisic acid[J].Aust J Grape Wine Res,2009,15:195-204.
[6]GAMBETTA G A,MATTHEWS M A,SHAGHASI T H,et al.Sugar and abscisic acid signaling orthologs are activated at the onset of ripening in grape[J].Planta,2010,232:219-234.
[7]KOYAMA K,SADAMATSU K,GOTO-YAMAMOTO N.Abscisic acid stimulated ripening and gene expression in berry skins of the cabernet sauvignon grape[J].Funct Integr Genom,2010,10:367-381.
[8]GIRIBALDI M,GENY L,DELROT S,et al.Proteomic analysis of the effects of ABA treatments on ripening Vitis vinifera berries[J].J Exp Botany,2010,61:2447-2458.
[9]GAGNE S,CLUZET S,MERILLON J M,et al.ABA initiates anthocyanin production in grape cell cultures[J].J Plant Growth Regulat,2011,30:1-10.
[10]NICOLAS P,LECOURIEUX D,KAPPEL C,et al.The bZIP transcription factor VvABF2 is an important transcriptional regulator of ABA-dependent grape berry ripening processes[J].Plant Physiol,2014,164:365-383.
[11]LACAMPAGNE S,GAGNÉ S,GÉNY L.Involvement of abscisic acid in controlling the proanthocyanidin biosynthesis pathway in grape skin：new elements regarding the regulation of tannin composition and leucoanthocyanidin reductase(LAR)and anthocyanidin reductase(ANR)activities and expression[J].J Plant Growth Regulat,2009,29:81-90.
[12]DEIS L,CAVAGNARO B,BOTTINI R,et al.Water deficit and exogenous ABA significantly affect grape and wine phenolic composition under in field and in vitro conditions[J].Plant Growth Regulat,2011,65(1):11-21.
[13]权桂蓉，高翔，惠竹梅.外源激素处理对葡萄及葡萄酒香气成分的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2020，48（1）：126-134.
[14]DAVIES C,BÖTTCHER C.Hormonal control of grape berry ripening[J].Grapevine Mol Physiol Biotechn,2009:229-261.
[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.GB/T 15038—2006 葡萄酒，果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.
[16]魏冬梅，张艳芳，张予林.利用比色法测定葡萄酒的酒精度[J].食品工业，2001（4）：45-46.
[17]吴莹.中国野生毛葡萄和葡萄酒抗氧化能力的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.
[18]王福荣.酿酒分析与检测[M].北京：化学工业出版社，2012：37-41.
[19]牛雪，张军翔，徐国前.葡萄与葡萄酒中总酚测定方法的研究进展[J].食品与机械，2016，32（3）：239-242.
[20]于韶洋，吴兆翔.葡萄酒的主体骨架—干浸出物[J].葡萄栽培与酿酒，1998（3）：39-41.
[21]夏国海，张大鹏，贾文锁.IAA、GA 和ABA 对葡萄果实14C 蔗糖输入与代谢的调控[J].园艺学报，2000，27（1）：6-10.
[22]雷鸣，吴江，程建徽等.ABA 与NAA 对红地球葡萄果实性状的影响[J].浙江农业科学，2008（2）：153-155.
[23]单守明，刘成敏，郝丹东，等.S-诱抗素对赤霞珠葡萄果实品质的影响[J].农业科学研究，2015（6）：1-4.
[24]徐志勇，周洋，王珍等.外源脱落酸和赤霉素对酿酒葡萄品质的影响[J].酿酒科技，2017（9）：65-70.
[25]MARZIA G,LAURENCE G,SERGE D,et al.Proteomic analysis of the ffects of ABA treatments on ripening Vitis vinifera berries[J].J Exp Botany,2010,6(9):2447-2458.
[26]ZHANG M,LENG P,ZHANG G L,et al.Cloning and functioning analysis of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)genes encoding a keyenzyme during abscisic acid biosynthesis from peach and grape fruits[J]. J Plant Physiol,2009,166(12):1241-1252.
[27]ZHANG D P.Abscisic acid:metabolism,transport and signaling[M].Berlin:Springer Netherlands,2014:271-286.
[28]LENG P,YUAN B,GUO Y D.The role of abscisic acid in fruit ripening and responses to abiotic stress[J].J Exp Botany,2014,65(16):4577-4588.
[29]KOYAMA K,SADAMATSU K,GOTO-YAMAMOTO N.Abscisic acid stimulated ripening and gene expression in berry skins of the Cabernet Sauvignon grape[J].Funct Int Genom,2010,10(3):367-381.
[30]JU Y L,LIU M,ZHAO H,et al.Effect of exogenous abscisic acid and methyl jasmonate on anthocyanincomposition,fatty acids,and volatile compoundsof Cabernet Sauvignon(Vitis vinifera L.)grape berries[J].Molecules,2016,21(10):1354.
[31]ZHU L,ZHANG Y,ZHANG W,et al.Effects of exogenous abscisic acid on phenolic characteristics of red Vitis vinifera grapes and wines[J].Food Sci Biotechnol,2016,25(2):361-370.
[32]JEONG S T,GOTO-YAMAMOTO N,KOBAYASHI S,et al.Effects of plant hormones and shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in grape berry skins[J].Plant Sci,2004,167(2):247-252.
[33]KOYAMA R,DE ASSIS A M,YAMAMOTO L Y,et al.Exogenous abscisic acid increases the anthocyanin concentration of berry and juice from'Isabel'grapes(Vitis Labrusca L.)[J].Hort Sci,2014,49(4):460-464.
[34]YAMAMOTO L Y,DEASSIS A M,ROBERTO S R,et al.Application of abscisic acid (S-ABA) to cv.Isabel grapes (Vitis vinifera×Vitis labrusca)for color improvement:Effects on color,phenolic composition and antioxidant capacity of their grape juice[J].Food Res Int,2015,77:572-583.
[35]SANDHU A K,GRAY D J,LU J,et al.Effects of exogenous abscisic acid on antioxidant capacities,anthocyanins,and flavonol contents of muscadine grape(Vitis rotundifolia)skins[J].Food Chem,2011,126(3):982-988.
[36]FERRARA G,MAZZEO A,MATARRESE A M S,et al.Application of abscisic acid(S-ABA)to'Crimson Seedless'grape berries in a mediterranean climate:effects on color,chemical characteristics,metabolic profile,and S-ABA concentration[J].J Plant Growth Regulat,2013,32(3):491-505.
[37]张明霞，吴玉文，段长青.葡萄与葡萄酒香气物质研究进展[J].中国农业科学，2008，41：2098-2104.
[38]El HADI M A,ZHANG F J,WU F F,et al.Advances in fruit aroma volatile research[J].Molecules,2013,18(7):8200-8229.
[39]PARK S K,MORRISON J C,ADAMS D O,et al.Distribution of free and glycosidically bound monoterpenes in the skin and mesocarp of Muscat of Alexandria grapes during development[J]. J Agr Food Chem,1991,39:514-518.
[40]WILSON B,STRAUSS C R,WILLIAMS P J.Changes in free and glycosidically bound monoterpenes in developing Muscut grapes[J].J Agr Food Chem,1984,32:919-923.