随着社会发展和生活水平的提高，人们越来越趋于消费绿色新鲜、安全营养、益生健康的功能食品，非酒精发酵果蔬饮品日益受到消费者关注[1]。益生菌是指通过摄入适当的量，对食用者有健康益处的活的微生物[2]，具有抑菌消炎[3]、增强机体免疫力[4]、抗肿瘤[5-6]等功效。目前人们获取益生菌主要途径是通过摄入发酵乳制品，SILANIKOVE N等[7]研究发现全球约有75%的人存在乳糖不耐受症状，同时乳制品还有胆固醇含量过高、牛奶蛋白过敏等缺陷，很大程度限制了人们获取益生菌[8]。苹果营养全面且均衡，富含碳水化合物、有机酸、维生素和矿物质元素等[9]，大量研究表明，苹果可作为益生菌发酵的良好基质[10-12]。
本研究利用植物乳杆菌发酵苹果全果浆，充分保留苹果全果的营养物质，并通过超声波-酶法的预处理方式，利用酶反应高效且专一的特点，促进大分子果胶、膳食纤维、淀粉等营养物质分解成小分子并溶出[13-16]，最大程度提高苹果浆生物利用率。在单因素试验的基础上，以活菌数和感官评分为响应值，结合响应面法优化苹果浆发酵工艺条件，通过比较发酵前后抗氧化活性的变化，为开发一种绿色营养、健康保健的发酵苹果浆提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果：品种为“红富士”，甘肃省庆阳市；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21824：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂（生化试剂）：美国Solarbio公司；纤维素酶（20万U/g）、果胶酶（30万U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；铁离子还原能力试剂盒（ferric reducing antioxidant power，FRAP）：苏州科铭生物技术有限公司；2,2'-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazo-line-6-sulfonic acid），ABTS）检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BSA224S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV4802型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；LRH-250型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；BL-75G型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SC-298型立式菌种保藏柜：青岛海尔股份有限公司；HR2096型飞利浦搅拌机：飞利浦电子（香港）有限公司；HH-S4电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；TGL-16MC冷冻离心机：长沙维尔康湘鹰离心机有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
取甘油保存的植物乳杆菌菌液于MRS固体培养基上划线活化，37 ℃恒温培养24 h后，挑取长势较好的单菌落接种于MRS液体培养基中扩培，活化1～2次。充分活化后的菌液4 000 r/min离心10 min，取沉淀用生理盐水（0.9%氯化钠无菌水溶液）溶解，同时进行菌落计数，备用。
1.3.2 超声波-酶法预处理苹果浆
新鲜苹果清洗后去核、打浆，快速加入0.06%（w/w）Na2SO3搅拌均匀，加入复合酶（纤维素酶∶果胶酶=1∶1，0.07%）后超声处理（200 W，10 min，55 ℃），置于55 ℃水浴中继续酶解50 min。酶解结束后，用NaOH溶液（3 mol/L）调整苹果浆pH为5.0，于121 ℃灭菌10 min[17]迅速冷却待用。
1.3.3 发酵
将重悬后的植物乳杆菌接入上述苹果浆中，34 ℃静置发酵72 h后，得发酵苹果浆，取样测定指标。
1.3.4 单因素试验
设定接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%（V/V），发酵温度分别为28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃，发酵时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h，考察接种量、发酵温度及发酵时间对苹果浆发酵的影响。
1.3.5 Box-Behnken中心组合试验设计
为确定苹果浆最佳发酵工艺参数，依据单因素试验结果，选择接种量、发酵温度、发酵时间为影响因素，以活菌数和感官评分为响应值，根据Box-benhnken中心组合设计原理，运用Design-Expert 8.6.0.1软件设计响应面试验，因素与水平见表1。
表1 苹果浆发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for apple pulp fermentation conditions optimization
1.3.6 测定方法
（1）活菌数、可滴定酸和感官评价测定
活菌数采用GB4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的倾注平板计数法测定。可滴定酸参照GB 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法测定。
感官评价采用9分制的评分方法[18]，满分36分。邀请9名具有食品发酵相关专业知识背景的老师对发酵苹果浆进行感官品评，评分细则详见表2。
表2 发酵苹果浆感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented apple pulp
（2）总抗氧化活性测定
铁离子还原能力、ABTS自由基清除能力的测定均采用试剂盒法。铁离子还原能力单位为U/mL，ABTS自由基清除能力以1 mL样品中的Trolox等效抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示，单位为μmol Trolox/mL。
1.3.7 数据统计分析
所有试验均重复3次，数据处理和显著性差异分析采用Origin2018和SPSS24.0软件，实验设计和数据处理采用Design-Expert 8.0.6.1软件。
2 结果与分析
2.1 苹果浆发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 接种量对发酵苹果浆的影响
图1 接种量对发酵苹果浆活菌数、可滴定酸和感官评分的影响
Fig.1 Effect of inoculum on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp
如图1所示，随着乳酸菌接种量的增加，苹果浆发酵体系中的活菌数呈现先增加后下降的趋势。研究表明，接种量过高，发酵速度过快，过酸的环境和生存竞争反而会影响乳酸菌生长[19]，当接种量为10%时，其活菌数达到最大值8.68 lg（CFU/mL）。体系中可滴定酸随着接种量的增加呈现逐步升高的趋势，但发酵过快产酸过多会影响感官品评，当接种量为10%时感官评分达到最大值。因此，选择接种量为8%、10%和12%。
2.1.2 发酵温度对发酵苹果浆的影响
图2 发酵温度对发酵苹果浆活菌数、可滴定酸和感官评分的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp
如图2所示，随着发酵温度的升高，发酵体系的活菌数、可滴定酸和感官评分均呈现先上升后降低的趋势。31 ℃、34 ℃、37 ℃均适宜乳酸菌发酵，当发酵温度为34 ℃时，体系中活菌数达到最大值8.65 lg（CFU/mL）。随着发酵温度的继续升高，体系中活菌数、可滴定酸和感官评分均呈现下降趋势，说明该条件已不适宜乳酸菌生长代谢。因此，选取发酵温度为31 ℃、34 ℃和37 ℃。
2.1.3 发酵时间对发酵苹果浆的影响
图3 发酵时间对发酵苹果浆活菌数、可滴定酸和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp
发酵时间影响乳酸的产量和口感，如图3所示，随着发酵时间的延长，发酵体系中的活菌数和感官评分呈现先上升后下降的趋势，可滴定酸表现为先增加后趋于平缓。在发酵第72小时，发酵体系中活菌数达到最大值8.53lg（CFU/mL），此时感官评分也达到最大值33.01，可滴定酸含量随着发酵时间的延长而不断累积增加，但是过量的酸积累会引起过酸的口感。因此，选择发酵时间为60 h、72 h和84 h。
2.2 苹果浆发酵工艺优化BBD响应面试验结果
依据单因素试验结果，选择接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为自变量，活菌数（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，运用Box-Behnken试验设计优化苹果浆发酵工艺，结果见表3。
表3 苹果浆发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface methodology for apple pulp fermentation conditions optimization
利用响应面软件Design expert 8.0.6.1对表3试验结果进行多元回归拟合，获得响应值活菌数（Y1）和感官评分（Y2）的回归模型方程式分别为：
对这两个模型进行回归与方差分析，结果见表4和表5。
表4 以活菌数为评价指标的回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model using viable cell count as evaluation index
注：“**”表示影响极显著（P＜0.01），“*”表示影响显著（P＜0.05）。下同。
表5 以感官评分为评价指标的回归模型方差分析结果
Table 5 Variance analysis results of regression model using sensory evaluation as evaluation index
由表4可知，模型显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型复相关系数R2为0.9894，校正决定系数R2为0.9758，说明该模型拟合度较高。各因素对发酵苹果浆中活菌数的影响程度从强到弱依次为：接种量＞发酵时间＞发酵温度，且结合表中F值可知，接种量（A）、发酵时间（C）、接种量和发酵温度的交互项（AB）、接种量的二次项（A2）、发酵温度的二次项（B2）和发酵时间的二次项（C2）为极显著影响因素（P＜0.01），发酵温度（B）为显著影响因素（P＜0.05），其他因素影响较小。
由表5可知，模型显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型复相关系数R2为0.989 0，校正决定系数R2为0.974 7，说明模型拟合度较高。由P值可知，各因素对发酵苹果浆感官评分的影响程度从强到弱依次为：发酵温度＞接种量＞发酵时间，且结合表中F值可知，接种量（A）、发酵温度（B）、接种量和发酵时间的交互项（AC）、发酵温度和发酵时间的交互项（BC）、接种量的二次项（A2）、发酵温度的二次项（B2）和发酵时间的二次项（C2）为极显著影响因素（P＜0.01），其他因素影响较小。
根据回归方程作各因素对活菌数及感官评分影响的响应面图，结果见图4。
图4 接种量、发酵时间和发酵温度交互作用对活菌数及感官评分影响的响应面及等高线图
Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on viable cell count and sensory evaluation
由图4可知，接种量和发酵温度对活菌数含量的交互效应极显著（P＜0.01）。随着发酵时间的延长，苹果浆中活菌数呈现先增长后逐渐减少的趋势，在接种量为9%～10%，发酵时间为66～72 h时，活菌数较大；接种量和发酵时间、发酵温度和发酵时间对感官评分的交互影响效应极显著（P＜0.01）。
经过Design-Expert8.0.6.1软件优化处理后，以活菌数为主要评价指标，得到乳酸菌发酵苹果浆的最佳工艺条件为：接种量10.08%（V/V），发酵温度34.43 ℃，发酵时间70.6 h；以感官评分为主要评价指标，得到乳酸菌发酵苹果浆的最佳工艺条件为：接种量9.79%（V/V），发酵温度34.75 ℃，发酵时间70.98 h。为保证益生菌发酵苹果浆最佳活菌数，同时参考感官评分评价指标，将该方案优化修约后，得到乳酸菌发酵最佳工艺条件为：接种量10%（V/V），发酵温度34 ℃，发酵时间71 h，通过三组平行试验得到发酵苹果浆的活菌数为9.01 lg（CFU/mL），感官评分33.91，与模型预测值较为吻合。
2.3 发酵苹果浆的抗氧化能力
表6 发酵前后苹果浆的抗氧化活性
Table 6 Antioxidant activity of apple pulp before and after the fermentation
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表6可知，与未经发酵的苹果浆相比，发酵后的苹果浆FRAP铁离子还原能力、ABTS自由基清除能力显著提高（P＜0.05）。叶盼等[20]利用植物乳杆菌发酵苹果汁，发酵后的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和ABTS自由基清除能力显著增强，发酵后的苹果汁抗氧化性能得到提高。这可能是因为乳酸菌在发酵过程中产生了水解酶，使部分结合态多酚水解成游离酚，并且高酸环境阻止了酚类物质的降解，从而提高了发酵后果汁的抗氧化活性。
3 结论
本研究以苹果浆为原料，结合乳酸菌发酵苹果浆，在单因素试验的基础上，以活菌数和感官评分为响应值优化苹果浆发酵工艺参数。确定乳酸菌发酵苹果浆最佳工艺条件为：接种量10%，发酵温度35 ℃，发酵时间71 h。在此优化条件下，发酵苹果浆的活菌数实际值为9.01 lg（CFU/mL），感官评分实际值为34分。与未经发酵的苹果浆相比，发酵后的苹果浆FRAP铁离子还原能力、ABTS自由基清除能力分别提高了5.78%和18.41%，说明乳酸菌发酵苹果浆可有效提高产品的抗氧化活性。该研究为开发一种绿色营养、益生健康的发酵苹果浆提供理论依据。
[1]SZUTOWSKA J.Functional properties of lactic acid bacteria in fermented fruit and vegetable juice:a systematic literature review[J]. Eur Food Res Technol,2020,246:357-372.
[2]FAO/WHO.FAO/WHO Joint Expert consultation report:evaluations of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk and live lactic acid bacteria[R].Cordoba Argentina:FAO,2001.
[3]CASTAGNINI C,LUCERI C,TOTI S,et al.Reduction of colonic inflammation in HLA-B27 transgenic rats by feeding Marie Ménard apples,rich in polyphenols[J].Brit J Nutr,2009,102(11):1620-1628.
[4]KOBER M M,BOWE W P.The effect of probiotics on immune regulation,acne,and Photoaging[J].Int J Women's Dermatol,2015,1(2):85-89.
[5]MASAKASU T,SAYA H,AI T,et al.Probiotic beverage with soy isoflavone consumption for breast cancer prevention:a case-control study[J]. Curr Nutr Food Sci,2013,9(3):194-200.
[6]KUUGBEE E D,SHANG X Q,GAMALLAT Y,et al.Structural change in microbiota by a probiotic cocktail enhances the gut barrier and reduces cancer via TLR2 signaling in a rat model of colon cancer[J].Digest Dis Sci,2016,61(10):2908-2920.
[7]SILANIKOVE N,LEITNER G,MERIN U.The interrelationships between lactose intolerance and the modern dairy industry:global perspectives in evolutional and historical backgrounds[J].Nutrients,2015,7(9):7312-7331.
[8]DI CAGNO R,CODA R,DE ANGELIS M,et al.Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J].Food Microbiol,2013,33(1):1-10.
[9]PIMENTEL T C,MADRONA G S,GARCIA S,et al.Probiotic viability,physicochemical characteristics and acceptability during refrigerated storge of clarifiled apple juice supplemented with Lactobacillus paracasei ssp.paracasei oligofructose in different package type[J].LWT-Food Sci Technol,2015,63(1):415-422.
[10]DIMITROVSKI D,VELICKOVA E,LANGERHOLC T,et al.Apple juice as a medium for fermentation by the probiotic Lactobacillus plantarum PCS 26 strain[J].Ann Microbiol,2015,65(4):2161-2170.
[11]XU X X,BAO Y J,WU B B,et al.Chemical analysis and flavor properties of blended orange,carrot,apple and Chinese jujube juice fermented by selenium-enriched probiotics[J].Food Chem,2019,289:250-258.
[12]张晶，陈悦，余偲，等.短乳杆菌发酵苹果汁工艺优化及有机酸变化[J].食品与发酵工业，2020，46（2）：180-187.
[13]王占一，张立华，王玉海，等.超声波辅助纤维素酶提取石榴幼果多酚及其抑制α-葡萄糖苷酶活性[J].食品科学，2017，38（18）：214-221.
[14]芦宇，吕长鑫，纪秀凤，等.超声波-纤维素酶辅助提取红树莓籽黄酮及其体外消化研究[J].中国食品学报，2019，19（11）：100-107.
[15]MIESZCZAKOWSKA-FRAC M,DYKI B,KONOPACKA D.Effects of ultrasoundon polyphenol retention in applesafter the application ofpredrying treatments in liquid medium[J].Food Bioproc Technol,2015,9:543-552.
[16]王杉杉，马韵升，姚刚，等.超声波辅助复合酶法提取枸杞多糖工艺研究[J].中国酿造，2015，34（7）：134-137.
[17]袁晶，张海燕，曾朝珍，等.超声波辅助复合酶法提取苹果多酚工艺优化[J].保鲜与加工，2019，19（6）：159-163.
[18]张丽华，王小媛，刘梦培，等.植物乳杆菌发酵红枣汁的工艺条件优化及体外抗氧化活性[J].中国食品学报，2019，19（1）：83-88.
[19]易晓成，万萍，白娜.响应面法优化益生菌发酵青稞饮料工艺[J].中国酿造，2018，37（1）：116-120.
[20]叶盼，吴慧，王德纯，等.发酵苹果汁的抗氧化性能变化[J].食品与发酵工业，2016，42（4）：114-119.