发酵食品是人类长期历史进程中，在一定自然环境条件下形成的具有独特风味、丰富营养和良好保藏性的食品。通过发酵不仅可以改变食品的风味，还可以提高营养价值，延长保藏期。世界各地的传统发酵制品分布广泛，许多国家都具有各具特色的发酵制品，如中国的腐乳、酱油、鱼露等，日本的纳豆，韩国的泡菜以及欧美的干酪、酸奶等[1]。赵培城等[2]采用绍兴腐乳毛霉对低值海产鱼糜固态发酵，制成与豆腐乳形态相似口感细腻的鱼糜腐乳；周绪霞等[3]对鱼糜接种真菌进行固态发酵；LADISLAUS K[4]使用豆豉发酵剂发酵鱼酱，发现鱼酱的营养价值和生物活性都有显著提高；ANUPAM G等[5]利用曲霉发酵鱼糜制作鱼酱，并对鱼酱发酵过程中抗氧化性、还原性的变化规律以及蛋白降解的规律进行研究，发现在鱼酱制作的过程中抗氧化性和还原性呈逐渐升高的趋势，且大分子蛋白逐渐降解为小分子。目前世界各国的鱼业生产都存在着经济鱼类逐年减少，低值小杂鱼产量逐年增多的问题，因此如何加工利用低值小杂鱼开发新蛋白产品，已引起世界各国的重视。
本研究以鱼糜制品为研究对象，借鉴传统发酵食品的发酵工艺和原理，采用混合菌发酵鱼腐乳，前期使用毛霉发酵，后期采用红曲卤汁发酵制作鱼腐乳，研究鱼腐乳在发酵的过程中游离氨基酸（free amino acid，FAA）及抗氧化活性的变化规律，旨在为开发鱼腐乳产品优化风味及稳定产品品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
FA级冷冻鱼糜：福建某水产开发有限公司；总状毛霉（Mucor recemosus）：百惠生物科技有限公司；红曲霉（Monascus）F1：本实验室保存菌株。
17种氨基酸标准品（分析纯）：美国Sigma公司；水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢、邻苯二甲醛、芴甲氧羰酰氯、乙腈（分析纯）：国药集团化学有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：北京索莱宝公司；食盐、淀粉、高粱酒均为食品级：市售。
1.2 仪器与设备
Agilent100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；3-30 K冷冻离心机：德国SIGMA公司；FD-1-50真空冷冻干燥器：北京博医康仪器公司；UV-2000紫外分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：北京国华科技集团有限公司；PHX150生化培养箱：宁波莱福科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 鱼腐乳的制作工艺及操作要点[6]
冷冻鱼糜在4 ℃冰箱解冻后，空擂5 min，加入鱼浆质量3%的NaCl后再盐擂10 min，加入淀粉，继续擂溃10 min，加热成型，冷却后接种毛霉菌，27 ℃前发酵培养4 d，得到毛坯；撮毛后表面包裹10%食盐，腌制1 d后置于经过消毒的玻璃瓶内，将制备好的红曲卤，兑入玻璃瓶内，密封，后期发酵。
分别取前发酵期第0天、第2天、第4天，咸坯，后发酵期第7天、第14天、第21天、第28天的样品进行测定。
1.3.2 游离氨基酸的测定
样品前处理：称取0.5 g样品，加0.01 mol/L盐酸，均质1 min，静置提取30 min，离心，取上清液定容至5 mL，过0.2 μm水系滤膜，上机分析。
检测条件：参考张洵[7]的方法，采用在线柱前衍生（安捷伦公司自动在线衍生化方法），一级氨基酸与邻苯二甲醛、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯衍生后过柱检测。
色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。流动相A：40 mmol/L磷酸二氢钠（pH7.8）；流动相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10（V/V）。
检测信号：除脯氨酸使用荧光检测外，其他氨基酸使用紫外检测。紫外检测波长为338 nm，荧光激发波长为266 nm，发射波长为305 nm。
1.3.3 游离氨基酸对鱼腐乳滋味的贡献评价方法
采用呈味强度值（taste active value，TAV）法评价单个游离氨基酸对鱼腐乳滋味的贡献，TAV表示各个呈味物质的含量与其阈值的比值[8]。计算公式如下：
式中：C1为某氨基酸的质量浓度；C2为相应氨基酸的阈值浓度。
1.3.4 抗氧化活性的测定
样品前处理：参照ANUPAM G等[5]提取抗氧化活性物质的方法，称取5 g样品。加入pH为7.2的0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液25 mL，低温匀浆5 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清，冻干备用。
DPPH自由基清除率的测定：将冻干样品，稀释成适当浓度，取1 mL待测样品，加入1 mL 50 μmol/L DPPH乙醇溶液，充分混匀，室温下避光反应30 min，于波长517 nm处测吸光度值，以1 mL乙醇代替样品作空白。DPPH自由基清除率计算公式如下：
羟自由基清除率的测定：在比色管中一次加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L乙醇-水杨酸，加入适量去离子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后摇匀，37 ℃水浴加热，15 min后取出，测其吸光度值A0，其计算公式如下：
式中：A0为空白对照的吸光度值，AX为加样品的吸光度值，AX0为不加显色剂吸光度值。
2 结果与分析
2.1 鱼腐乳发酵过程中游离氨基酸的变化
用高效液相色谱对鱼腐乳发酵过程中各阶段的游离氨基酸进行分析，鱼腐乳发酵过程中游离氨基酸含量的变化情况见表1。
表1 鱼腐乳发酵过程中游离氨基酸含量的变化
Table 1 Changes of free amino acid contents during fish sufu fermentation
注：“*”为必需氨基酸，“a”为鲜味氨基酸，“b”为疏水性氨基酸。
从表1可知，鱼腐乳在发酵过程中共检测出18种游离氨基酸，其中含有8种必需氨基酸，游离氨基酸和其含氮降解产物是发酵食品中重要的滋味物质和风味前体物质，是衡量发酵产品风味的一个重要指标[8]，发酵过程中总游离氨基酸的含量显著升高，前期毛霉在生长代谢过程中产生的蛋白酶会分解蛋白质为小肽或氨基酸，所以游离氨基酸的含量迅速升高，后期红曲卤的加入，带入了部分游离氨基酸，而且后期发酵的过程中蛋白质也会发生降解，所以游离氨基酸的含量继续升高，但后期游离氨基酸的增长幅度较小，可能是因为后期盐含量较高，抑制了蛋白酶的活性[9]，所以游离氨基酸的增长主要发生在前期发酵的过程中，后期成熟过程中游离氨基酸的含量增长缓慢。
发酵结束后总游离氨基酸的含量由52.56mg/100g增加至915.77 mg/100 g。其中8种必需氨基酸的含量由30.5 mg/100 g增加至491.68.70 mg/100 g，占总游离氨基酸的53.69%。谷氨酸和天冬氨酸是主要的鲜味物质，鲜味氨基酸的含量在发酵28d时，增加至138.57 mg/100 g，占总游离氨基酸的15.13%，精氨酸、蛋氨酸等的苦味阈值较低[10]，适当的苦味对产品的风味有利。另外，一些甜味氨基酸如甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸都有成倍的增加，产品会变得更加甘甜。
2.2 鱼腐乳发酵过程中各类氨基酸的变化规律
根据氨基酸的味型与味觉强弱，大致可将氨基酸分为鲜味氨基酸（Asp、Glu、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、苦味氨基酸（Val、Met、Ile、Leu、Arg）、芳香族氨基酸（Cys、Tyr、Phe）[10]。鱼腐乳发酵过程中各类氨基酸含量的变化及各类氨基酸呈味强度值的变化见图1及图2。
图1 鱼腐乳发酵过程中各类氨基酸含量的变化
Fig.1 Changes of various types of amino acid concentration during fish sufu fermentation
图2 鱼腐乳发酵过程中各类氨基酸呈味强度值的变化
Fig.2 Changes of various types of amino acid taste active value (TAV)during fish sufu fermentation
从图1、图2可以看出，在鱼腐乳发酵的过程中，鲜味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、总氨基酸的含量都呈逐渐升高的趋势，鲜味氨基酸在白坯（0 d）、毛坯（4 d）、咸坯、发酵最终产品（28 d）中的含量分别是3.6 mg/100 g、77.58 mg/100 g、104.31 mg/100 g、138.57 mg/100 g，含量明显增加。8种必需氨基酸是人体所不能合成的氨基酸，对于人体的营养均衡有很重要的作用，在鱼腐乳发酵的过程中，必需氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、发酵最终产品中的含量分别是30.60 mg/100 g、219.90 mg/100 g、266.55 mg/100 g、491.68 mg/100 g，最终发酵鱼腐乳的必需氨基酸含量较高。疏水氨基酸是侧链具有较高疏水性的一类氨基酸，具有疏水作用，对于保持蛋白质的三级结构以及维持生物膜结构等方面具有重要的作用。在鱼腐乳发酵的过程中，疏水氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、发酵产品中的含量分别是25.92mg/100g、343.84 mg/100 g、350.22 mg/100 g、340.06 mg/100 g，在前期发酵的过程中疏水氨基酸增长较快，在毛坯、咸坯以及最终产品中变化不是很明显。总游离氨基酸的含量在白坯、毛坯、咸坯和产品中的含量分别是52.56 mg/100 g、529.24 mg/100 g、656.46 mg/100 g、915.77 mg/100 g，总游离氨基酸的含量呈持续快速增长的趋势。研究还表明，发酵过程有助于鲜味物质增加，其中Asp、Glu和Lys三种鲜味氨基酸的呈味活性值提高显著，在发酵开始时分别为0.45、0.45、0.16，发酵第28天分别为19.62、16.03、4.78。此外，精氨酸的呈味活性值也有较大幅度变化。
LIN X等[12]从嗜热真菌和嗜温真菌中提取热稳定性好的亮氨酸氨基肽酶，酶活力为2 771.5 U/mL，将其应用于大豆蛋白水解，可以显著提高水解度，去掉N端的疏水氨基酸，降低苦味。XU Y W等[13]利用片球菌发酵鱼肉香肠，在发酵过程中游离氨基酸和非蛋白氮含量逐渐增加。王蔚新[14]在研究酸鱼发酵过程中蛋白质降解及其风味形成中发现经发酵后主要游离氨基酸为Glu、His、Lys、Ala、Leu和Asp等，其中Asp和Glu两种鲜味氨基酸的呈味活性值最高。在火腿的研究中[15-16]，发现游离氨基酸对火腿滋味贡献大，而且不同的存储条件影响火腿滋味。由此可见，发酵产品的滋味与所用原料、菌种、发酵工艺、存储条件等有一定关系。
2.3 鱼腐乳发酵过程中抗氧化活性的变化
鱼腐乳发酵过程中的DPPH自由基清除率与羟基自由基测定结果见图3。由图3可知，在鱼腐乳前期发酵的过程中，DPPH自由基清除率显著升高，在鱼腐乳后期成熟的过程中，DPPH自由基清除率呈缓慢升高的趋势。DPPH自由基清除率被广泛运用于测定产品抗氧化物质的含量，包括自由基清除能力以及作为氢供体。很多研究表明肽类和蛋白质水解物具有很强的抗氧化性，抗氧化肽作为一种潜在的抗氧化剂成为可能[17]。另外有一些关于鱼酱的研究也发现，一些氨基酸比如赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸也具有抗氧化活性[18-19]。在本研究中，鱼腐乳整个发酵的过程中，赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸都呈上升的趋势。在发酵过程中DPPH自由基清除率呈逐渐升高的趋势，发酵第0天和第28天时DPPH自由基清除率分别为17.21%和70.30%。发酵过程中，抗氧化能力增强也有可能是因为蛋白质在水解之后，部分具有抗氧化性的氨基酸残基暴露。GUO H等[19]认为，两肽或三肽比单个氨基酸抗氧化能力强，更易于吸收。关于鱼腐乳发酵中的两肽或三肽化合物变化情况有待进一步研究。
图3 鱼腐乳发酵过程中DPPH自由基和羟自由基清除率变化情况
Fig.3 Changes of DPPH radical and hydroxyl radical scavenging rates during fish sufu fermentation
在所有的自由基中，羟自由基被认为是目前所知破坏力最强、毒性最大的一种自由基。直接或间接的引起脂质氧化，蛋白质变性、酶失活以及机体的病变或死亡，因此可以用羟自由基清除能力来衡量抗氧化活性[20]。从图3可以看出，在前期发酵的过程中，羟自由基清除率呈较快速升高的趋势，发酵第0天、第4天的羟自由基清除率分别为38.97%和49.21%。后期成熟的过程中，羟自由基清除率呈缓慢升高的趋势，在第21天时为61.54%，第28天时达到63.11%。羟自由基清除率逐渐升高可能与发酵过程中蛋白质逐渐被水解，产生抗氧化肽及氨基酸有一定关系。
3 结论
本实验利用毛霉和红曲霉发酵制作鱼腐乳，对鱼腐乳发酵过程游离氨基酸及抗氧化活性的变化规律进行分析。在鱼腐乳发酵过程中，鲜味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、总氨基酸的含量都呈逐渐升高的趋势。鲜味氨基酸的含量由3.6 mg/100 g上升至138.57 mg/100 g，必需氨基酸的含量由30.60 mg/100 g升高至491.68 mg/100 g，疏水氨基酸的含量由25.92 mg/100 g上升至340.06 mg/100 g，总游离氨基酸的含量由52.56 mg/100 g升高至915.77 mg/100 g。Asp、Glu和Lys这3种鲜味氨基酸呈味活性值升高显著。鱼腐乳在发酵过程中DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均呈逐渐升高的趋势。综上所述，鱼腐乳发酵过程游离氨基酸总量、鲜味氨基酸及抗氧化活性均呈上升趋势。
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