葡萄（Vitis vinifera）是世界上最重要的果树之一，分布在世界各地，种植面积超过750万hm2，世界葡萄产量39%分布在欧洲，亚洲32%，美洲20%[1]，但葡萄易感染病毒病，如葡萄卷叶病毒、葡萄扇叶病毒、沙地葡萄茎痘病毒等。各国都在注重葡萄病毒病的研究[2]，目前，在全世界不同的葡萄品种中已记录了约70种葡萄病毒和类病毒[3]，国外正在积极使用高通量测序和宏基因组学技术对葡萄病毒生态进行持续的全面研究[4-5]。而我国20世纪80年代后才开始研究葡萄病毒病[6]，当前记录了约20种葡萄病毒病[7]，葡萄卷叶病毒中仅对葡萄卷叶病毒2（grapevine leaf-roll virus 2，GLRaV-2）与葡萄卷叶病毒3（grapevine leaf-roll virus 3，GLRaV-3）的研究较多，对其他病原的研究不足[8]。
烟台是全国著名的葡萄酒产区，酿酒葡萄栽培面积约为1万hm2，主栽品种为8个，蛇龙珠是主栽品种之一，面积约为0.133万hm2。调查发现蛇龙珠普遍存在葡萄卷叶病，即叶片反卷变红现象，发生率为51.31%～66.26%。本研究通过田间症状调查，将蛇龙珠分为叶片反卷和叶片正常两组，拟研究叶片反卷变红症状对蛇龙珠果实风味物质累积和果实品质的影响，同时利用小核糖核酸（small ribonucleic acid，sRNA）测序技术对两组植株进行病毒病原鉴定，为培育无病毒蛇龙珠苗木和配套精准化栽培技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蛇龙珠葡萄：蓬莱产区中粮酿酒葡萄基地。株行距为1 m×2 m，单干单臂＋直立叶幕整形。
氢氧化钠、葡萄糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚甲基蓝、盐酸、氯化钾、无水乙酸钠、甲醇、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、没食子酸、磷钼酸与无水乙醇等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；MDF-382E超低温冰箱：日本三洋电气集团；H13237型超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；Centrifuge5430R高速离心机：德国Eppendorf公司。
1.3 实验方法
1.3.1 采样
2018年在蛇龙珠葡萄果实成熟时，田间调查标记出带有叶片反卷症状和非叶片反卷症状的葡萄各20株，从葡萄座果期开始分期采样，于2019年7月8日，7月17日，8月14日，8月29日，9月19日和9月29日在两组葡萄树的不同部位随机选取各10穗健康葡萄果穗，置于装有冰袋的泡沫箱带回实验室备用；随机在两组葡萄树体上的阴阳两面、果穗上、中、下选取500粒健康果粒，部分直接放入-40 ℃冰箱贮存备用，用于测定果实还原糖与可滴定酸；部分剥取其果皮后放入液氮速冻，研磨成粉，保存于-80 ℃冰箱中贮存备用。
1.3.2 分析检测
蛇龙珠葡萄果实还原糖测定采用斐林试剂滴定法[9]；可滴定酸测定采用滴定法[9]；单宁测定采用福林丹尼斯法[9]；总酚测定采用福林-肖卡法[10]；花色苷测定采用pH示差法[11]。各选取卷叶和正常的10棵蛇龙珠，每棵葡萄剪取5根枝条，取其韧皮部，用锡箔纸包裹好并用液氮速冻，用干冰寄往上海欧易生物医学科技有限公司，采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq进行高通量测序。
1.3.3 数据处理
实验数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 小核糖核酸（sRNA）测序质量评估
叶片反卷症状（V：病株）sRNA和非叶片反卷症状（N：正常）的葡萄进行测序，结果见表1。由表1可知，正常叶片的蛇龙珠原始数据为21 300 061，叶片反卷变红的蛇龙珠原始数据为22 625 415，过滤掉原始数据中不合格的测序序列（reads）后，得到有效数据表现正常的蛇龙珠为21 067 763，有症状表现的蛇龙珠为22 373 700，有效率分别为98.91%与98.89%。测序错误率仅为0.01%。结果说明2个样品的测序质量较高，其获得的转录组数据可满足后续分析的需要。
表1 样品sRNA测序数据评估
Table 1 Data evaluation of small RNA sequencing of samples
注：“GC%”为碱基G和C的数量总和占总体碱基数量的百分比。
2.2 小核糖核酸（sRNA）测序病毒筛选
由于病毒感染的植物，大量积累21nt、22nt和24nt病毒短干扰siRNA（short interfering RNA，siRNAs）[12]，因此对上述得到的有效数据（clean reads），筛选碱基长度18～26 bp的sRNA来进行后续分析，结果见表2。由表2可知，两种处理sRNA总数和种类都不同：正常的蛇龙珠sRNA总数和种类分别为14 036 456和1 311 537；卷叶的蛇龙珠sRNA总数和种类分别为15 839 145和1 532 668。
表2 样品sRNA种类与数量
Table 2 Types and quantities of sRNA of samples
2.3 小核糖核酸（sRNA）测序鉴定卷叶蛇龙珠病毒种类
将有症状与无症状的样品拼接结果进行分类注释，检测其病毒分布情况，结果见表3。由表3可知，无症状表现植株共766个片段（contigs），其中有153个注释到非冗余蛋白数据库，703个注释到核酸序列数据库，3个注释到病毒核酸数据库，10个注释到病毒蛋白数据库，554个注释到宿主基因组序列数据库。有症状表现的植株共1 087个contigs，其中有212个注释到非冗余蛋白数据库，1 023个注释到核酸序列数据库，136个注释到病毒核酸数据库，82个注释到病毒蛋白数据库，728个注释到宿主基因组序列数据库。
表3 病毒注释结果统计
Table 3 Statistics results of virus annotated
叶片正常的蛇龙珠中，只在非冗余蛋白数据库中被注释到沙地葡萄茎痘病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）一种病毒，contigs数为2，两种类病毒分别是葡萄黄斑类病毒（grapevine yellow speckle viroid 1，GYSVd-1）和啤酒花矮化类病毒（hop stunt viroid，HSVd）等类病毒。叶片反卷的蛇龙珠中，共检测出7种已知葡萄病毒：分别是葡萄卷叶病毒3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）、葡萄卷叶病毒2（grapevine leafroll-associatedvirus 2，GLRaV-2）、灰比诺病毒（grapevinePinotgrisvirus，GPGV）、沙地葡萄茎痘病毒、葡萄根茎损坏相关病毒（grapevine rootstock stem lesion associated virus，GRSLaV）、葡萄病毒E（grapevine virus E，GVE）和葡萄斑点病毒（grapevine fleck virus，GFkV）。
在核酸序列数据库中被注释到的病毒最多，葡萄卷叶病毒3 contigs数为28，葡萄卷叶病毒2 contigs数为105，灰比诺病毒contigs数为1，沙地葡萄茎痘病毒contigs数为4，葡萄根茎损坏相关病毒contigs数为3，葡萄病毒E contigs数为1，葡萄斑点病毒contigs数为1。类病毒有葡萄黄斑类病毒1 contigs数为1，葡萄黄斑类病毒2（Grapevine yellow speckle viroid 2，GYSVd-2）contigs数为1，酒花矮化类病毒contigs数为2，葡萄锤头状类病毒contigs数为4。
在非冗余蛋白数据库中，注释到葡萄卷叶病毒3 contigs数为2，葡萄卷叶病毒2 contigs数为9，沙地葡萄茎痘病毒contigs数为1，葡萄根茎损坏相关病毒contigs数为13，未注释到葡萄类病毒。1种不知名病毒Lausannevirus，contigs数为1。
在病毒核酸数据库中注释到葡萄卷叶病毒3 contigs数为22，葡萄根茎损坏相关病毒contigs数为107，葡萄斑点病毒contigs数为1，葡萄病毒E contigs数为1，灰比诺病毒contigs数为1。未注释到葡萄类病毒。2种不知名病毒Tadarida brasiliensis circovirus 1 contigs数为1，Choristoneura occidentalis granulovirus contigs数为1。
在病毒蛋白数据库中注释到葡萄卷叶病毒3 contigs数为9，葡萄卷叶病毒2 contigs数为5，葡萄斑点病毒contigs数为1，葡萄根茎损坏相关病毒contigs数为53，沙地葡萄茎痘病毒contigs数为1，未注释到葡萄类病毒。有大量不知名病毒。
2.4 卷叶对蛇龙珠果实风味物质累积的影响
如图1所示，蛇龙珠叶片自7月初基部叶片开始反卷，随着时间的推移，反卷叶片逐渐上移，同时叶脉之间开始出现斑点，逐渐变红。
图1 不同采样时期蛇龙珠葡萄叶片反卷与变红程度
Fig.1 Reverse winding and reddening degree of grape leaves in different sampling periods
如表4所示，反卷叶片蛇龙珠的还原糖、总酚风味物质累积动态与正常植株基本保持一致，自7月8日开始一直处于含量增加状态，到果实成熟采收时含量达到最大；但与正常植株相比，其含量显著减少（P＜0.05）。自7月17日第二次采样一直到成熟采收的5次采样测定，反卷叶片的蛇龙珠还原糖含量与对照相比一直都是显著降低（P＜0.05），其中7月17日降低最明显，减少24.05%；反卷叶片的蛇龙珠总酚含量一直都低于正常植株，只有两次含量（7月8日和9月29日）差别达到显著水平（P＜0.05），其中7月8日降低最明显，减少36.90%。
表4 蛇龙珠葡萄果实风味物质含量检测结果
Table 4 Determination results of flavor substance content in Cabernet Gernische grape
注：不同的小写字母表示处理之间在存在显著差异（P＜0.05），“-”表示未检测。
反卷叶片蛇龙珠的花色苷累积动态与正常植株基本一致，含量呈现先增加后降低的趋势，但总量较刚开始测定时要多。反卷叶片蛇龙珠的花色苷含量一直是低于正常植株，8月14日和8月29日含量达到显著差异，其中8月4日降低最明显，减少47.64%。
反卷叶片蛇龙珠可滴定酸累积动态与正常植株不太一致，虽然总体趋势是逐渐减少，8月14日之前，含量一直比正常植株低，自8月14日开始含量高于正常植株，是正常植株的1.4倍，一直到采收，与正常植株相比都是显著性增加（P＜0.05）。
反卷叶片蛇龙珠单宁累积动态与正常植株不同，含量是增加到8月29日达到最大值，随后小幅度减少，但至采收前基本恢复到8月29日含量。正常植株单宁含量先增加到8月29日达到最大值，随后含量减少。叶片反卷蛇龙珠单宁含量8月29日和9月19日比正常含量减少，但幅度不明显，9月29日果实采收时是正常植株的1.41倍。
3 讨论
通过sRNA高通量测序鉴定植物携带病毒种类是最新的病毒病原鉴定方法，目前已经在苹果、葡萄等果树上应用。高通量同时对几十万到几百万条脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子测序，能够检测到样本中已知和未知的病毒[13]，现在有很多新病毒是通过该方法获得的，国外目前也是较多的使用此方法。sRNA测序其原理为植物体内的RNA沉默机制，通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）分子，鉴定出相关病毒[14]。下一代测序技术的出现使宏基因组学成为植物病毒学的一种可能方法，拓宽了诊断的潜力，并加深了对感染葡萄的病毒病原体的认识[15]。本研究通过sRNA测序鉴定出烟台产区叶片反卷的蛇龙珠携带7种已知病毒，4种类病毒和多种未知病毒，其中包括能够促进叶片反卷的卷叶病毒3与卷叶病毒2。而正常植株只携带1种病毒和2种类病毒。可以得出烟台产区蛇龙珠带毒情况严重，至于单株携带病毒种类以及哪些病毒导致叶片反卷以及红斑不同需要进一步深入研究。比起常规反转录-聚合酶链反应（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR），其检测结果更精确，不仅确定了病毒种类，还确定了类病毒种类以及未知的病毒。
通过前期的田间调查和田间测定发现由于携带多种病毒和类病毒，叶片反卷植株树体生长减缓，但也能较好的控制蛇龙珠旺长，导致结果枝百分率和每结果枝果穗数明显增加，HALLDORSON M M等[16]也检测到植株感染葡萄卷叶病毒后芽活力下降。这对于生产者来说是件好事，因为烟台产区蛇龙珠普遍存在旺长现象，需要长梢修剪，否则结果枝率偏低。
但通过室内测定指标发现卷叶植株大部分风味物质累积动态趋势与正常植株比较一致，而原糖、总酚、花色苷含量与正常植株相比显著减少，这与目前AKBAS,B等[17-20]有关葡萄卷叶病研究表明的卷叶病对果实品质影响的结果一致。而本研究测得单宁前期保持不变，随后经历了先降低后升高，这与ALABI B等[21]在对梅鹿辄为试材连续三年的研究结果相同。唯一不同的是可滴定酸含量比正常植株增加，也就是说叶片反卷植株降酸较慢，这在生产上对于烟台产区来说又是一个好现象，因为酿酒者普遍反应蛇龙珠这个品种降酸太快。
4 结论
本研究明确了叶片反卷变红蛇龙珠的主要病毒和类病毒种类，携带7种已知病毒与4种类病毒和多种未知病毒，并且对果实品质影响较大，反卷叶片的蛇龙珠还原糖含量显著降低，其中7月17日降低最明显，减少24.05%；总酚含量一直都低于正常植株，7月8日降低最明显，减少36.90%；花色苷含量在8月4日降低最明显，减少47.64%；单宁累积动态与正常植株不同。葡萄一旦感染病毒，便终身带毒，因此一定要培育并采用蛇龙珠无毒苗木，确保葡萄产业健康持续发展。
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