荔波蜜柚是当地特色农产品属于一种芸香科柑橘类水果，其果实有淡淡的清香味，具有口感酸甜、凉润等特点[1-2]。蜜柚的营养成分丰富，富含糖类、维生素、矿物质、类黄酮，具有健脾、润肺、补血、清肠、利便等功效，其果肉中含有类似胰岛素成分的铬和生物活性物质生物苷，具有降低血液黏稠度，减少血栓形成，对脑血栓、脑卒中等脑血管疾病有较好的的预防作用[3-5]。其酿造的蜜柚果酒营养价值高，含有17种氨基酸、维生素和矿物质，具有饮用滋补双重作用[6-7]。
荔波当地的蜜柚年产量较大，蜜柚被加工成为地方特色系列产品。其酿造的蜜柚果酒以其果香优雅怡人，酒体清亮透明，酒香浓郁，口感纯正而受到越来越多的消费者所青睐。据研究表明，香气是构成果实和果酒质量、典型性的主要因素[8]，也是对酒感官评定的一个直接影响因素[9]，气-质联用技术分析酒类香气成分是当前有效分的析方法。游玉明[10]通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析柚子酒经超高压处理后香气成分中产生了芳樟醇、乙酸异戊酯等新物质。移兰丽等[11]通过GC-MS联用技术分析沙田柚蒸馏酒在橡木桶陈酿过程中有风味增加的变化情况，使其香气更为浓郁。杜昌陈等[12]通过GC-MS检测到添加柚果皮能够增加沙田柚二次蒸馏酒中月桂烯和柠檬烯的含量，改善其蒸馏酒的风味品质。
当前，关于蜜柚发酵酒与其经过陈酿的蒸馏酒香气成分还鲜有报道。本研究以蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒为研究对象，采用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）、气-质联用（GC-MS）技术对其香气成分进行分析，并应用香气成分的定量结果与该物质的香气阈值比得到香气活性值[13]来评价它们对蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒香气特性的贡献程度。为进一步研究荔波蜜柚酒提供数据支撑和研发地方特色蜜柚酒奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜜柚：贵州省黔南布依苗族自治州荔波昌辉食业公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷（分析纯）：上海桥杜生物科技有限公司；无水葡萄糖、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；次甲基蓝、酚酞（均为分析纯）：天津市化学试剂供销公司。
1.2 仪器与设备
新II型果酒蒸馏机组：河南新乡中轻机械有限公司；北京科伟永兴仪器有限公司；DH5000 II恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；LH-B55数显糖度计：杭州陆恒生物科技有限公司；YM-060ST超声波清洗机：深圳市方奥微电子有限公司；HP6890/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纤维头：美国Supelco公司；FB-5MS气相色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm）：美国J&W Scientific公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蜜柚酒的酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
预处理：挑选新鲜蜜柚，清洗去除杂质和异物，去皮去籽破碎得纯果肉。
成分调整：预处理好的果肉按照料水比（92∶43）进行混合，称取15%的白砂糖进行溶糖，根据实际经验值（16.8 g/L的发酵液经发酵后产1%vol酒精）调节初始发酵液的浓度为240 g/L，以期达到发酵后的蜜柚果酒发酵液酒精度为（14±0.5）%vol。
发酵：发酵液中加入酵母（接种量0.05%）进行28 ℃恒温发酵，不添加SO2，发酵时间12～14 d，当残糖含量＜4 g/L时发酵结束。
酒渣分离：发酵液经过压滤机过滤后再进行后发酵30 d得到蜜柚果酒。
蒸馏：蒸馏温度90 ℃、蒸馏压力0.01 MPa、蒸馏速率2.60 kg/min、冷凝水流量4.70 kg/min。馏出液进行去除1%酒头和去除20%酒尾处理，酒体酒精度为（65±2）%vol，此条件下得到的酒为蜜柚蒸馏酒。
陈酿：地下室自然陈酿28 d根据实际所需进行调配并转入储存罐进入陈酿阶段（6～9个月）。
灭菌：（85±1）℃保温15 min灭菌，即得蜜柚发酵酒和蒸馏酒。
1.3.2 蜜柚酒的理化检测
蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒的理化指标分析测定按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]、GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[15]进行测定；蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒的感官指标分析分别参照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[15]和赵莹[16]的方法来制定执行。
表1 蜜柚发酵酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards for fermented pomelo wine
1.3.3 香气成分的提取
精密量取酒样置于10 mL固相微萃取仪采样瓶中，精密加入混标（甲醇溶解，环己酮1.54 μg，壬酸甲酯0.83 μg）和转子，水浴60 ℃保温，同时以250 r/min转速搅拌，插入装有已活化的1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纤维头手动进样器，顶空萃取40 min，移出萃取头，立即插入气相色谱仪进样口（温度250 ℃）中，热解吸6 min后进样，供GC-MS分析[16]。
1.3.4 色谱-质谱联用仪检测
色谱条件：FB-5MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱温38 ℃（保留4 min），以3 ℃/min升温至128 ℃，再以7 ℃/min升温至268 ℃，运行54 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；柱前压6.98 psi，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间1 min。质谱条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1565V；接口温度280℃；质量范围29～500amu[16]。
1.3.5 数据分析方法
定性定量方法：对总离子流色谱图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Wiley275和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014标准质谱图确定挥发性成分的种类得出定性结果、经内标法进行定量分析，以测定物质的峰面积与待定物质的质量浓度之比等于内标峰面积与内标质量浓度之比计算出各挥发性物质的含量。挥发性成分的香气活性值（odor activity value，OAV）计算方法参考文献[13]。
2 结果与分析
2.1 感官鉴定及理化指标结果分析
蜜柚酒的感官鉴定及理化指标分析对于判定酒的品质和风味至关重要，感官评分结果由1名国家专业品酒评审委员和4名从事酒行业的专业工作人员进行品评打分，对5名品评人员的打分求平均值并计算最后得分，满分100分。蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒感官及理化指标分析结果分别见表2和表3。
表2 蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒感官评分结果
Table 2 Sensory evaluation results of fermented wine and distilled liquor of pomelo
从表2可看出，蜜柚蒸馏酒的感官评分总体比蜜柚发酵酒的高，总分为86.8分，蜜柚蒸馏酒酒体澄清透明，具有优雅的果香与酒香、醇和圆润的口感且具有蜜柚酒独特的风格。蜜柚发酵酒感官评分欠佳是由于其酒体后味较苦涩，其中蜜柚原料带来的苦、发酵过程中形成大量高级杂醇类物质带来的苦都有可能是导致蜜柚发酵酒后味变苦涩的原因，具体复杂化的原因还需要进一步的试验探索研究。
表3 蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒基本理化指标
Table 3 Basic physical and chemical indexes of fermented wine and distilled liquor of pomelo
从表3可看出，蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒发酵彻底，总糖含量＜4 g/L。酿造工艺的不同使得各理化指标含量存在较大的差异，蜜柚蒸馏酒中总酸和总酯的含量相对偏低，会使得酒体稍微有点单薄且余味短，可能是试验操作不当或使用的发酵菌种单一造成。总体来说，蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒中的各理化指标均符合国标GB/T 15038—2006和GB/T 10345—2007的限量标准，其果香与酒香突出，香味协调，口感纯正，具备蜜柚酒独特的风格。
2.2 蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒的香气成分分析结果
利用GC-MS分析蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒的风味成分，总离子流色谱图分别见图1和图2。风味物质种类及含量见表4、表5。
图1 柚子发酵酒香气成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of fermented pomelo wine analysis by GC-MS
图2 蜜柚蒸馏酒香气成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of distilled pomelo liquor analysis by GC-MS
表4 蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒风味物质分类
Table 4 Classification of flavor substances in fermented wine and distilled liquor of pomelo
表5 蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒风味物质种类及相对含量
Table 5 Types and relative contents of flavor substances in fermented wine and distilled liquor of pomelo
注：“-”表示未检出。
由表4和表5可知，蜜柚发酵酒中共检测出24种香气成分，其中醇类化合物5种，占柚子发酵酒总香气成分相对含量的28.19%，酯类化合物12种（31.28%），酸类化合物1种，占香气成分的比例最大（37.42%），其他类化合物6种（3.11%），醛酮类和烯烃类未检出。蜜柚蒸馏酒中共检测出19种香气成分，2种醇类物质，分别为异戊醇和苯乙醇，异戊醇含量为525.08 mg/L，占蜜柚蒸馏酒总香气成分相对含量的68.47%，是蜜柚蒸馏酒中相对含量最多的香气成分，在酒中表现出浓郁的指甲油香气和威士忌香气[17-18]，苯乙醇含量为12.54 mg/L（1.63%），具有典型的玫瑰花香气[19]，其含量是蜜柚发酵酒的1.6倍，可能是蜜柚蒸馏酒在蒸馏的过程中香气成分得到一定程度的浓缩。酯类化合物7种（25.98%），醛酮类化合物糠醛（3.50%），烯烃类化合物2种（0.15%），其他化合物7种（0.25%），羧酸类物质未检出。
2.3 蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒香气成分分析
在蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒中共检测出4种酯类，2种醇类和3种烷烃类共9种共同香气成分，主要体现为蕉香、菠萝香和柑橘香的水果香，玫瑰、蔷薇等花香，还伴有酒精、蜡香和奶油香。其中具有奶油香的棕榈酸乙酯香气成分相对较大，对酒体香气贡献突出，可判断是蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒主要的呈香物质。
酯类物质是在发酵和蒸馏过程中由醇和酸经过酯化反应生成，主要在发酵过程中产生，是构成花香和果香的主体，在各种酒品的香气组成中占有重要地位[17，20]。挥发性香气成分中酯类化合物的数量是较多的一类，蜜柚发酵酒中酯类物质含量为380.99 mg/L，是蜜柚蒸馏酒中酯类化合物相对含量的2倍，分别在蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒中占全部检出挥发性风味物质含量的31.28%和25.98%，其差距较大的原因可能是在蒸馏和陈酿过程中酯类物质部分挥发或散失导致。各种酯类化合物在酒中的差异也较大，其中丁二酸二乙酯、月桂酸丁酯、棕榈酸甲酯、9-十六烷酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯和硬脂酸乙酯在发酵酒中出现，蒸馏酒中未检出。棕榈酸乙酯，油酸乙酯，亚油酸乙酯等是一类高碳脂肪酸乙酯，其中亚油酸乙酯在人体内可以水解产生人体必需脂肪酸—亚油酸，具有重要的活性功能[19]。蜜柚蒸馏酒中检测到具有青草香的乳酸乙酯，菠萝香的辛酸乙酯和乙酸异戊酯在发酵酒中未检出，其相对含量分别占蜜柚蒸馏酒总香气成分的21.14%、0.34%和2.09%，其中乙酸异戊酯具有强烈的果香味并带有梨的酸甜味，是香精香料合成的重要中间体[21]。
醇类化合物主要通过酵母发酵代谢、蛋白质分解等生成[22]。醇类化合物在蜜柚蒸馏酒中的相对含量是较高的，为537.62 mg/L，其相对含量远大于在蜜柚发酵酒中的含量343.33 mg/L，分别在蜜柚蒸馏酒和蜜柚发酵酒中占全部检出挥发性风味物质含量的70.11%和28.19%。醇类化合物在各种酒中的差异赋予了酒不同的风味特征，如检测到2,3-丁二醇的相对含量较高，为252.76 mg/L，占蜜柚发酵酒总挥发性香气成分含量的20.75%，在发酵酒中呈现浓郁的甜香和奶香，而在蜜柚蒸馏酒中未检出。两者相同的醇类香气组分是异戊醇和苯乙醇，蜜柚蒸馏酒中异戊醇含量（525.08 mg/L）是蜜柚发酵酒（62.04 mg/L）的8.5倍，因此，在蜜柚蒸馏酒中呈现出浓郁的指甲油香、香油香；其次是苯乙醇，蜜柚蒸馏酒中含量为12.54 mg/L（蜜柚发酵酒中为7.80 mg/L），是经磷酸戊糖途径酵母利用有氧呼吸生成赤藓糖后形成的，具有清甜的玫瑰花香、蔷薇花香。适宜浓度的高级醇能赋予蜜柚酒酒体特殊的香味，使酒体丰满柔和，圆润醇厚。
酸类化合物主要来源于脂肪酸代谢途径或长链脂肪酸的降解[23]，是酒中重要的风味物质，对酒体的香气主要为助香，减少刺激，维持酯类及缓冲平衡的辅助作用[24]。在蜜柚发酵酒中只检测到了乙酸这一种化合物，这与赵莹[16]试验检测结果一致。其相对含量为455.79 mg/L，占蜜柚发酵酒香气成分比例较大，在酒中呈现出强烈的酸味，而蒸馏酒中未检出。高浓度的酸可能是本试验中新酒比较刺激辣喉，香气不协调的原因之一。
2.4 蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒香气活性分析
根据表5中的数据结果，参照各文献香气阈值计算各物质的OAV，选择对蜜柚酒香气贡献较明显及香气活性值＞1的能被人感知的化合物进行分析，结果见表6。
表6 蜜柚发酵酒与蜜柚蒸馏酒中OAV＞1的主要挥发性风味化合物
Table 6 Volatile flavor compounds of OAV＞1 in fermented wine and distilled liquor of pomelo
注：在蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒中OAV＜1的物质未被列入此表，香气阈值和香气描述参考文献[25-35]。
结果表明，分析鉴定出蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒中共有13种贡献较大的挥发性香气成分，其中醇类5种、酯类6种、糠醛和乙酸，是构成蜜柚发酵酒及蜜柚蒸馏酒香气特性的主要成分类别。这些香气成分部分来源于蜜柚原料自身，能够形成蜜柚酒独特的品种特征性，另一部分来源于发酵陈酿过程中形成的各化合物之间相互协调作用产生的香气。酒体中香气活性值越大，则香气越突出，蜜柚发酵酒中按香气活度值大小依次排序分别是乙酸、棕榈酸乙酯、2,3-丁二醇、十四酸乙酯、苯乙醇、葵酸乙酯、反式橙花叔醇、月桂酸乙酯、异戊醇，其中OAV值较大的乙酸可能来源于操作环境控制不当，使得在发酵过程中有醋酸菌等产酸杂菌入侵，导致酒体酸味过烈，口感粗糙。研究表明，酸量少，则酒味淡且余味短，只有适量的酸才能对酒体有缓冲，协调，烘托主体香的作用[35]。OAV值次之的棕榈酸乙酯（蜡香、果香、奶油香）和2,3-丁二醇具有的甜香、果香，是构成了蜜柚发酵酒酯香的关键物质，也是酒体中香气贡献较大的呈香物质。蜜柚蒸馏酒中OAV＞100较高的是乙酸异戊酯（OAV=100.1）和糠醛（OAV=220.1），具有浓郁的蕉香、坚果香和馊香[33]是构成蜜柚蒸馏酒香气贡献最大的呈香物质，也是本试验中区别于蜜柚发酵酒所具有的独特香气风格。蜜柚蒸馏酒中的异戊醇（OAV=17.5）和苯乙醇（OAV=8.9）对酒体香气贡献明显高于在蜜柚发酵酒中的贡献程度，在蜜柚蒸馏酒中呈现出浓郁的指甲油香和玫瑰花香，也是构成酒体醇香、醚香、蕉香[36]的特征香气物质。
此外，蜜柚发酵酒和蜜柚蒸馏酒中相对香气活性值较小的挥发性物质也是构成其酒体独特风味的重要部分，各香气成分之间相互融合，相互抑制的作用能够使酒体香气突出，优雅纯正，风味更为多元化。
3 结论
本试验以蜜柚发酵酒与蒸馏酒为研究对象，主要对其挥发性香气成分经GC-MS技术定性，内标法定量和OAV值进行分析，同时进行感官评分及基本理化指标测定。结果显示，从蜜柚发酵酒中共检测到24种香气成分，主要是醇类、酯类、羧酸类等其他类化合物；从蜜柚蒸馏酒中共检测到19种香气成分，主要是醇类、酯类、醛酮类、烯烃类等其他类化合物。蜜柚发酵酒中香气贡献较大（OAV＞1）的有9种，其中对酒体香气贡献最大的是乙酸，其次是棕榈酸乙酯和2,3-丁二醇；蜜柚蒸馏酒中香气贡献较大（OAV＞1）的有10种，其中对酒体香气贡献最大的是糠醛，其次是乙酸异戊酯和异戊醇，这些物质结合其他香气成分共同赋予了蜜柚蒸馏酒蕉香、指甲油香、坚果香、玫瑰花香等香气特征。
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