2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）是造成葡萄酒软木塞污染的主要成分之一，它是由一类生长在软木塞内的霉菌，为了去除其生长环境中的2,4,6-三氯苯酚，作为一种脱毒机制而产生的物质[1-2]。因其具有强烈的泥土和发霉气味[3-4]，痕量的TCA便会令人不悦。美国食品药品监督管理局的研究报告表明，消费者对于TCA的阈值水平一般在3.1 ng/L[5]。瓶装后经木塞迁移到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身还稳定，而且该过程基本是不可逆的[6-7]，根据测算，全球每年因TCA污染而造成的葡萄酒损失可达100亿美元[8]。
TCA在软木塞和葡萄酒中的含量都非常低（ng/L水平），因此，高效的前处理萃取技术和灵敏度极高的检测方法是必不可少的，应用最多的是顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法或气相色谱-电子捕获检测器法[9-10]。目前，国家尚未明确规定软木塞中TCA的限量标准，但各葡萄酒企业对木塞中TCA的限量比较低，基本都在2 ng/L，有些天然塞要求在1 ng/L。通常使用分析结果作为决策依据时，必须对结果的可靠性有所了解[11]。因此，木塞中TCA的迁移量不仅要求检测准确，而且在限量值附近的结果可靠。不确定度是对测定结果的信息补充，反映了测量结果可信程度的高低；它一方面便于评定结果的可靠性，另一方面也可增强实验室间或实验室内部测量结果间的可比性[12]。
本研究参照中国合格评定国家认可委员会CNASGL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[12]、中华人民共和国国家计量技术规范JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[13]及国际标准化组织ISO 20752—2014《cork stoppers—determination of releasable 2,4,6-trichloroanisol（TCA）》[14]，对软木塞中TCA检测的不确定度进行评定，旨在为评价测量数据的准确性、可靠性提供科学依据，并通过分析不确定度的主要影响因素，后期重点把控以确保检测结果的准确、可靠。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验所用软木塞由某生产厂商提供，每批次取样40个，密封包装后备用。
本方法使用符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；四无乙醇（色谱纯）：天津市光复精细化工研究所；无水乙醇、氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）标品（纯度99.5%）、2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）-D5标品（纯度98.8%）：Dr.EhrenstorferGmbh公司。固定相为5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷共聚物：美国瑞斯泰克公司。
1.2 仪器与设备
GC-MS QP2010Ultra气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）装置；100 μm PDMS SPME萃取头：上海安谱实验科技股份有限公司；低极性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。
1.3 实验方法
1.3.1 TCA系列标准溶液配制
准确称取TCA标品10 mg，用四无乙醇定容至100 mL容量瓶，质量浓度为100 mg/L，作为TCA标准储备液。用12%乙醇溶液逐级稀释至质量浓度为100 ng/L，再分别配制质量浓度为20 ng/L、10 ng/L、5 ng/L、2.5 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L系列标准溶液。
1.3.2 TCA-D5内标工作液配制
准确称取TCA-D5标品10mg，用四无乙醇定容至100mL容量瓶，质量浓度为100 mg/L，作为TCA-D5内标储备液。用12%乙醇溶液逐级稀释至质量浓度为1 000 ng/L，作为TCA-D5内标工作液。
1.3.3 样品处理
在室温下将20个软木塞置于1 L广口瓶内，倒入乙醇溶液直至充满广口瓶，浸泡24 h后取出浸提液，作为样品溶液。称取1.5 g氯化钠于20 mL顶空样品瓶中，加入5 mL样品溶液和0.1 mL的TCA-D5内标工作液，压盖，备用。
1.3.4 仪器参数设置
固相微萃取：平衡温度40 ℃，平衡时间5 min，搅拌速度250 r/min；萃取温度40 ℃，萃取时间30 min；解吸温度250 ℃，解吸时间5 min；萃取头老化温度260 ℃，老化时间1 min。
进样口温度：250℃。升温程序：初始柱温70℃，以10℃/min升温至160 ℃；再以25 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min。进样方式：不分流进样，1 mL/min。载气：高纯氦气（He）。色谱与质谱接口温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟时间7 min。
1.3.5 数学模型的建立
根据ISO 20752—2014的测定原理及检测过程，并参考CNAS-GL006：2019[12]和JJF1059.1—2012[13]，待测物中TCA含量（ng/L）的计算公式如下：
式中：X为样品中TCA的质量浓度，ng/L；f为TCA的相对校正因子；A为样品中TCA的峰面积；Ai为添加于样品中内标TCA-D5的峰面积；I为内标物的质量浓度（添加在样品中），ng/L；Asi为标样f值测定时内标TCA-D5的峰面积；As为标样f值测定时TCA的峰面积；c为标样中TCA的质量浓度，ng/L；csi为内标物TCA-D5的浓度（添加在标样中），ng/L。
1.3.6 不确定度来源分析
通过对检测过程和数学模型的分析，影响木塞中TCA含量不确定度的因素有：（1）重复性测定引入的不确定度；（2）样品加标回收率产生的不确定度；（3）标准系列配制引入的不确定度（包括：标准物质和内标物质纯度、标准物质和内标物质称量、标准物质和内标物质稀释、标准溶液系列配制）[15-17]；（4）标准曲线拟合引入的不确定度；（5）样品制备引入的不确定度（包括：12%乙醇溶液配制、样品取样、添加内标物）。木塞中TCA含量测定不确定度分量因果关系见图1。
图1 不确定度分量因果关系图
Fig.1 Causality diagram of uncertainty components
2 结果与分析
2.1 各分量不确定度的计算
2.1.1 重复性测定引入的不确定度
与测量结果直接相关的重复性测量过程，包括样品的均匀性测量、设备的重复性以及样品前处理过程的重复性，这一分量可由测量结果的重复性表示。在重复条件下对某一木塞浸提液进行8次平行试验，测量数据见表1。
表1 重复性试验测量结果
Table 1 Determination results of repeated tests
测量结果重复性引入的标准不确定度
，相对标准不确定度
0.008 1。
2.1.2 样品加标回收率引入的不确定度
在本底值为2.04 ng/L的样品溶液中加入TCA标准溶液，加入量为2.00 ng/L，并重复测定6次，测得值及回收率如表2所示。
表2 样品回收率测定结果
Table 2 Determination results of recovery rates of samples
回收率平均值的标准不确定度u（r′）=
0.559 3，其相对标准不确定度为ur（r′）=
0.005 6。
2.1.3 标准溶液配制引入的相对不确定度
（1）标准物质和内标物质纯度引入的相对不确定度
TCA标准品的纯度为99.5%，扩展不确定度为0.5%（k=2）；TCA-D5标准品的纯度为98.8%，扩展不确定度为1.0%（k=2）。则由标品纯度引入的相对不确定度[18-19]分别为：
（2）标准物质和内标物质称量引入的相对不确定度
配制TCA与TCA-D5标准储备液时需称量标品各0.01 g，要求使用的天平最小分度为0.01 mg。JJG 1036—2008《电子天平检定规程》[20]规定，该准确级的天平在0.01～5.00 g称量的最大允差为±0.05 mg，与天平检定证书结果一致。属均匀分布，所以相对不确定度分别为：
（3）标准物质和内标物质稀释引入的相对不确定度
标品：称取TCA标品0.01 g，用四无乙醇定容至100 mL容量瓶，TCA标准储备液质量浓度为100mg/L；之后用12%乙醇溶液逐级稀释至TCA质量浓度为100ng/L（1mL→100 mL，1mL→100 mL，1 mL→100 mL）。
第一步所使用的100 mL容量瓶，经校准符合A 级[21]，其允差为±0.10 mL，以三角分布计
，由此引入的不确定度为
=0.04，相对不确定度为：ur（d0）=
实验室温度控制在（20±2）℃，乙醇的体积膨胀系数为7.5×10-4/℃，假设温度变化呈均匀分布，k=
，则由温度引起体积变化的不确定度[22]为：u（t0）=
=0.09，相对不确定度为：ur（t0）=
0.000 9。则TCA标品定容引入的相对不确定度为：ur（D0）=
第二步逐级稀释引入的相对不确定度分量见表3。
表3 2,4,6-三氯苯甲醚标准储备液逐级稀释引入的不确定度
Table 3 Uncertainty introduced by successive dilution of 2,4,6-trichloroanisole standard reserve solution
注：实验所用容量瓶、吸量管、移液器经检定全部合格，符合相应级别，因此其最大容量允差均参照相应规程[21，23-24]。12%乙醇溶液的体积膨胀系数根据乙醇和水（2.08×10-4/℃）的近似换算，为2.73×10-4/℃。
由表3可知，一级稀释引入的相对不确定度为：
同理，二级稀释引入的相对不确定度为：
三级稀释引入的相对不确定度为：ur（D3）=0.002 9。
综上，标准物质TCA稀释引入的相对不确定度ur（D）=
内标：称取TCA-D5标品0.01 g，用四无乙醇定容至100mL容量瓶，TCA标准储备液质量浓度为100 mg/L；之后用乙醇溶液逐级稀释至TCA-D5质量浓度为1 000 ng/L（2 mL→100 mL，2 mL→100 mL，2.5 mL→100 mL）。
由表4可知，TCA-D5标品定容引入的相对不确定度为：
表4 2,4,6-三氯苯甲醚内标物质逐级稀释引入的不确定度
Table 4 Uncertainty introduced by successive dilution of 2,4,6-trichloroanisole-D5 internal standard reserve solution
一级稀释引入的相对不确定度为：
同理，二级稀释引入的相对不确定度为：
三级稀释引入的相对不确定度为：ur（D3内）=0.008 2。
综上，内标物质TCA-D5稀释引入的相对不确定度
（4）标准溶液系列配制引入的相对不确定度
配制20 ng/L的标准溶液引入的相对不确定度为ur（p20）=
同理ur（p10）=0.012 5，ur（p5）=0.014 8，ur（p2.5）=0.021 8，ur（p1）=0.016 7，ur（p0.5）=0.036 5。因此，标准溶液系列配制引入的相对不确定度为：ur（p）=
表5 2,4,6-三氯苯甲醚系列标准溶液配制引入的不确定度
Table 5 Uncertainty introduced in the preparation of 2,4,6-trichloroanisole series standard solution
由于标准溶液配制完成后，需分别取5 mL标液、100 L内标加入样品瓶。则：
（a）标准溶液取样引入的相对不确定度
用A级5 mL单标线吸量管移取标准溶液，最大容量允差为±0.015 mL，按均匀分布考虑，k=
，由此引入的相对不确定度为ur（V）=
=0.001 7。实验室温度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的体积膨胀系数为2.73×10-4/℃，假设温度变化呈均匀分布，k=
，则由温度引起体积变化的相对不确定度为：ur（t）=
。则标准溶液取样引入的相对不确定度
0.001 7。
（b）添加内标物质引入的相对不确定度
用100 μL移液器移取内标液100 μL，最大容量允差为±2.0 μL，按均匀分布考虑，k=
，由此引入的相对不确定度为ur（V）=
=0.011 5。实验室温度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的体积膨胀系数为2.73×10-4/℃，假设温度变化呈均匀分布，k=
，则由温度引起体积变化的相对不确定度为：ur（t）=
。则添加内标物质引入的相对不确定度ur（V内）=
0.011 5。
综上可知，标准系列溶液上仪器之前，因取标样和添加内标物引入的相对不确定度为：
所以，标准溶液系列配制这一步最终引入的相对不确定度为：
由2.1.3（1）～（4）可知，标准溶液系列配制全过程引入的相对不确定度为：ur（P总）=
0.060 9。
2.1.4 标准曲线拟合引入的相对不确定度
以TCA与TCA-D5的峰面积比为纵坐标，TCA浓度为横坐标，所得标准曲线回归方程为：Y=0.066 3X；线性相关系数R2为：0.999 9。标准曲线产生的不确定度源于标准曲线残差的标准偏差，残差为测量值Y与标准曲线拟合值Y′之差的绝对值
。TCA标准曲线残差计算见表6。
表6 2,4,6-三氯苯甲醚标准曲线残差计算
Table 6 Calculation of residuals for 2,4,6-trichloroanisole standard curve
标准曲线峰面积比残差的标准差
0.000 4，n为标准样品测试次数6。
标准曲线拟合引入的标准不确定度根据公式u（f）=
计算，b为斜率，p为样品X0的测试次数（本实验测定8次），X¯为标准溶液的平均质量浓度。则u（f）=0.003 6（X0=2.04 ng/L），由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度ur（f）=
2.1.5 样品制备引入的相对不确定度
（1）12%乙醇溶液配制引入的相对不确定度
由于TCA的迁移量与乙醇浓度有关，因此应考虑12%乙醇溶液配制引入的相对不确定度。用250 mL量筒移取乙醇240 mL，容量允差为±1.0 mL，按均匀分布考虑，k=
由此引入的相对不确定度为ur（V）=
=0.002 4；实验室温度控制在（20±2）℃，乙醇的体积膨胀系数为7.5×10-4/℃，假设温度变化呈均匀分布，k=
，则由温度引起体积变化的相对不确定度为：ur（t）=
。因此，由量筒移取引入的相对不确定度ur（量筒）=
0.002 6。
将乙醇定容至A级2000mL容量瓶，容量允差为±0.6mL，按均匀分布考虑，k=
，由此引入的相对不确定度为
=0.000 2；实验室温度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的体积膨胀系数为2.73×10-4/℃，假设温度变化呈均匀分布，k=
，则由温度引起体积变化的相对不确定度为：ur（t）=
。因此，由定容引入的相对不确定度ur（定容）
12%乙醇溶液配制引入的相对不确定度ur（溶）=
（2）样品取样引入的相对不确定度
由2.1.3（4）（a）可知，样品取样引入的相对不确定度ur（样）
（3）添加内标物质引入的相对不确定度
由2.1.3（4）（b）可知，添加内标物质引入的相对不确定度ur（内）
综上，样品制备引入的相对不确定度ur（s）=
0.011 9。
2.2 合成标准不确定度
TCA检测过程相对不确定度分量见表7。
表7 2,4,6-三氯苯甲醚相对不确定度分量
Table 7 Relative uncertainty subscale of 2,4,6-trichloroanisole
合成相对标准不确定度为
试样中TCA含量的平均值X=2.04 ng/L，则标准不确定度
2.3 扩展不确定度的评定
根据CNAS-GL006：2019[12]，取置信区间P=95%，包含因子k=2；根据公式扩展不确定度U=uc（X）×2，则TCA的扩展不确定度为UTCA=0.26。最终检测结果可表示为：TCA含量X=（2.04±0.26）ng/L，k=2。
3 结论
本文采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪对木塞中TCA含量进行测定，并对该过程可能引入不确定度的因素进行深入考量、评定。结果表明，标准溶液系列配制过程引入的不确定度最大，其次是内标物质添加过程；而重复性测定、加标回收率、标品稀释等过程引入的不确定度相对较小，标品称量、样品取样、乙醇溶液配制等引入的不确定度可忽略不计。当木塞中TCA迁移量为2.04 ng/L时，其扩展不确定度为0.26 ng/L（k=2）。因此，实验过程中可通过提高实验人员的操作水平、定期校准玻璃仪器、严格控制操作环境温度、定期核查气质联用仪等来减小测量不确定度，从而提高检测结果的准确度、可靠性。
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