癫痫是一种慢性脑部疾病,已成为神经系统疾病中仅次于脑卒中的第二大常见病,根据世界卫生组织统计,截至2018年8月全世界患病人数约为6 500万人[1]。癫痫以脑部神经元过度放电所致突然的、短暂的、反复的中枢神经系统功能失常为特征[2],记忆力下降等认知功能障碍是其常见伴随症状,严重危害患者健康并影响生存质量。
癫痫的发病机制目前有多种学说[3-4],其中之一为氨基酸学说,兴奋性氨基酸的释放和抑制性氨基酸的减少可以通过多种途径导致癫痫的发生,如钙/钙调蛋白途径和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路等。在缺氧、缺血、脑外伤及惊厥等神经病理条件下,MAPK迅速被激活,调控多种细胞因子和炎性介质的表达分泌,使多种底物发生磷酸化反应,进一步调控基因的转录,从而发挥关键性作用[5]。
白首乌(Cynanchum bungei)又名白人参,江苏省滨海县出产了国内95%的白首乌,当地饮用白首乌酒已有悠久的历史,近年来当地政府与四川泸州老窖集团携手打造“百年白首”养生酒更是将白首乌酒的研究推向新的高度[6]。有报道称,白首乌主要含有二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)等生物活性物质,并含有多种营养成分及生物活性物质,具有抗衰老[7-8]、抗炎[9-11]、抗动脉粥样硬化[12-13]、护肝[14]、抗氧化和自由基清除[15-16]等功效。本研究探讨白首乌酒对癫痫大鼠神经元保护作用及其机制,以期为白首乌保健酒的进一步开发提供理论指导。
1.1.1 材料
雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),3周龄,体质量(40±10)g:中国食品药品监督管理研究院(License no.:SCXK(Beijing)2014-0013);白首乌酒(52%vol):泸州老窖养生酒业有限责任公司;白首乌酒提取物(Cynanchum bungei liquor extract,CBLE):500 mL白首乌酒于55 ℃条件下水浴减压旋蒸2 h至不再有液体蒸出,得240 mL液体白首乌酒提取物。
1.1.2 试剂
氯化锂、匹罗卡品:美国Sigma公司;硫酸阿托品:漯河市方汇药业有限公司;蛋白裂解液、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)总蛋白浓度测定试剂盒:北京盒子生工科技有限公司;鼠抗p38MAPK抗体、鼠抗二抗:美国Cell Signaling Technology公司;蛋白Marker:北京索莱宝科技有限公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶快速配制试剂盒、SDS-PAGE电泳液、转膜液:江苏碧云天生物技术研究所;水合氯醛:陕西盘龙翊海医药有限公司。所用试剂均为分析纯。
YP2001B电子天平:上海力辰仪器科技有限公司;DYCZ-24N垂直电泳仪:北京六一生物科技有限公司;Trans-Blot SD转膜系统:上海赛百奥科技有限公司;Odyssey红外激光成像系统:美国LI-COR生物技术有限公司。
1.3.1 动物的分组
健康雄性SD大鼠50只,置于通风条件良好的室内。相对湿度控制在(55±5)%,温度(23±2)℃。常规饮食,自由摄食摄水,喂食1周以适应环境。采用常规12 h昼/12 h夜循环。50只SD大鼠随机分为4组,分别为空白组、模型组、白首乌酒提取物低剂量组(CBLEL,4 mL/kg)、白首乌酒提取物高剂量组(CBLEH,10 mL/kg)。
1.3.2 癫痫动物模型的建立及后续干预
SD大鼠经腹腔注射氯化锂(127mg/kg),18~20h后腹腔注射硫酸阿托品注射液(1mg/kg),30min后腹腔注射40mg/kg匹罗卡品,直到出现癫痫持续状态,每只大鼠匹罗卡品注射剂量≤60 mg/kg。空白组用生理盐水代替氯化锂及匹罗卡品,其他组处理方式同上。观察大鼠腹腔注射匹罗卡品后行为学变化。
癫痫性发作等级评价标准采用Racine评分分级标准:0级:无任何不良反应;Ⅰ级:面部阵挛以及有咀嚼运动;Ⅱ级:以点头或甩尾为主的肌肉抽搐;Ⅲ级:单侧肢体的阵挛及抽搐;Ⅳ级:双侧前肢阵挛,伴有站立现象;Ⅴ级:抽搐,持续站立、身体背曲强直、跌倒。根据以上评价标准,出现Ⅳ级以上发作后进入惊厥持续状态认为建模成功,为降低大鼠死亡率,在癫痫状态后60 min给予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射以终止癫痫持续状态,若癫痫仍不停止,可重复注射地西泮(10 mg/kg)2~3次,直到癫痫持续状态停止[17-18]。
空白组:腹腔注射等体积的生理盐水,注射完成后观察大鼠的行为学变化;CBLEL组:在建模过程中,使用匹罗卡品前30 min腹腔注射4 mL/kg的白首乌酒提取物,注射完成后观察大鼠的行为学变化;CBLEH组:在建模过程中,使用匹罗卡品前30 min腹腔注射10 mL/kg的白首乌酒提取物,注射完成后观察大鼠的行为学变化。所有大鼠于模型组大鼠癫痫状态持续24 h后处死,取相应的器官进行后续实验。记录所有组大鼠癫痫发作的潜伏期,以及24 h内癫痫发作次数。
1.3.3 大鼠脑组织的处理
苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法处理所需脑组织:大鼠腹腔注射10%水合氯醛,待大鼠进入麻醉状态后,用斩头器取大鼠头颅,剪开颅骨,取出脑组织浸泡于4%的组织固定液中,送至武汉塞维尔生物科技有限公司进行HE染色以及切片扫描。
蛋白印迹(Western bolt)处理所需脑组织方法:大鼠腹腔注射10%水合氯醛,待大鼠进入麻醉状态后,用斩头器取大鼠头颅,剪开颅骨,取出脑组织,于冰上快速分离双侧海马和邻近颞叶皮质,置于冻存管中,放于-80℃冰箱中备用[18]。
1.3.4 蛋白免疫印迹分析
具体方法参照陈倩等[17]的蛋白印迹试验方法。
1.3.5 数据分析
采用SPSS 19.0软件进行相关性分析,数据表示为“平均值±标准差”(mean±SD),组间数据比较采用t检验,采用GraphPad Prism 5.0软件进行组间方差分析,显著性差异以P<0.05为标准。Western blot条带用Image J软件。
癫痫是一种危害人类神经系统健康的疾病,癫痫发作的强度、次数以及持续时间等表观现象可以反映癫痫疾病的轻重程度[19]。由表1可知,与空白组相比,模型组的Racine评分、癫痫发作次数和首次癫痫发作持续时间较高(P<0.05);与模型组相比,CBLE各剂量组分的Racine评分、癫痫发作次数和首次癫痫发作持续时间减低(P<0.05);CBLEH与CBLEL组相比,随着CBLE剂量的增加,Racine评分、癫痫发作次数和首次癫痫发作持续时间降低,这说明高剂量的CBLE可以减轻癫痫症状。
表1 CBLE对癫痫大鼠Racine评分、癫痫发作次数及首次癫痫发作持续时间的影响
Table 1 Effect of CBLE on Racine score,epilepsia seizure frequency and first epilepsia seizure duration of epileptic rats
注:“a”表示与空白组比较差异显著,P<0.05;“b”表示与模型组比较差异显著,P<0.05。
脑神经的损伤是癫痫发作给机体带来损害的一个重要体现,海马神经元的损伤和脱失在癫痫的发生过程起到关键性的作用,两者存在因果关系[20]。空白组的大鼠海马神经细胞组织紧密,数量较多,排列整齐,细胞核清晰可见(图1A);模型组大鼠海马神经细胞与空白组大鼠海马神经细胞相比较排列松散,有明显的细胞缺失,排列不规整,细胞核出现萎缩(图1B);CBLE各剂量组的大鼠海马神经细胞与模型组大鼠海马神经细胞相比,组织紧密性有明显提高,数量也较多,排列整齐度也有所提高;通过图1C与图1D比较可以发现,高剂量的CBLE可以使癫痫发作大鼠的海马神经细胞形态更趋近于正常的大鼠海马神经细胞。
图1 CBLE对癫痫大鼠海马神经元结构的影响
Fig.1 Effect of CBLE on hippocampal neuron structure in epileptic rats
A.空白组;B.模型组;C.CBLEH组;D.CBLEL组。
p38MAPK蛋白是一种应激蛋白激酶,高热、高渗透压、脂多糖等刺激可以迅速激活p38MAPK的信号传导通路[21]。癫痫作为一种对机体的强烈刺激可导致p38MAPK磷酸化激活,p38MAPK蛋白的表达量可以反映癫痫的轻重程度。由图2可知,经Western blot检测发现,空白组中p38MAPK蛋白有基础表达;模型组中的p38MAPK蛋白表达量较大,p38MAPK/GADPH比值与空白组的值相比差异具有统计学意义(P<0.05);高低剂量的CBLE的p38MAPK/GADPH比值与模型组的值相比都有差异性,且差异具有统计学意义(P<0.05);不同剂量的CBLE都可以减少p38MAPK蛋白的表达,CBLE高剂量组中p38MAPK蛋白量更加趋近于空白组,对这说明CBLE可以一定程度的减缓癫痫对机体造成的强烈刺激。
图2 CBLE对癫痫大鼠海马区p38MAPK蛋白表达的影响
Fig.2 Effect of CBLE on the expression of p38MAPK protein in hippocampus of epileptic rats
a表示与空白组比较差异显著,P<0.05;b表示与模型组比较差异显著,P<0.05。
本研究发现,随着CBLE剂量的增加,Racine评分、癫痫发作次数和首次癫痫发作持续时间降低,表明高剂量的CBLE可以减轻癫痫症状。高剂量的CBLE干预可以使癫痫发作的大鼠海马神经细胞形态更趋近于正常的大鼠海马神经细胞。这表明CBLE对癫痫大鼠神经元具有保护作用。本研究还发现,CBLEH和CBLEL可以减少p38MAPK蛋白的表达,CBLEH组中p38MAPK蛋白表达量更加趋近于空白组,表明CBLE干预后可以一定程度的抑制癫痫对机体的刺激,抑制p38MAPK蛋白的表达。
本研究证实了癫痫会对动物大脑海马神经元细胞造成损伤,CBLE干预后可以减轻这种损伤,其机制可能是通过抑制38MAPK蛋白的表达来实现的。这为白首乌酒的进一步开发提供了理论基础。
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