库尔勒香梨（Pyrus communis L.）为蔷薇科梨，属植物白梨的果实，是新疆原产优质特色品种[1-2]。其果实肉质细腻、味甜多汁、香味浓郁，富含多种营养成分。库尔勒香梨果酒风味口感独特，具有良好的保健功能，越来越受消费者喜爱。虽然香梨酒的酿造工艺已相对成熟，但仍存在一些技术问题亟需解决，例如果汁的氧化和褐变，香气成分丢失和有机酸含量过高等。当前，在香梨酒的酿造过程中，通常会加入二氧化硫来防止果酒的氧化变质和抑制杂菌生长，但二氧化硫与酒中化合物反应生成的有毒物质，不利于人体健康[3-4]。因此，需要寻找一种更合适的防腐剂或添加剂用于降低甚至替代二氧化硫的使用。
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽，它天然存在于大多数真核生物和许多原核生物中[5]。GSH具有巯基等多种官能团，表现出较强的生理活性，具有抗氧化、解毒、清除自由基、抗辐射和维护蛋白质及免疫系统正常功能的作用[6]。世界葡萄与葡萄酒组织（International Organization of Vine and Wine，OIV）规定GSH为葡萄汁和葡萄酒的安全添加物，这为生产健康安全的高品质果酒提供了科学的指导[7]。研究证实，GSH可以作为防腐剂用于葡萄酒和苹果酒中[8]。然而，GSH对果酒品质影响的研究较少，XU J N等[9]研究认为，苹果酒发酵过程中加入20 mg/L GSH可提升果酒品质，这是因为GSH的添加可提升总酚含量，并改变香气特征。因此，本研究以新疆库尔勒香梨为原料，制备香梨酒，通过分析不同GSH添加量（0、10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L）在酒精发酵过程中对香梨酒的基本理化成分、酚类物质、挥发性香气和感官特性的影响，探讨GSH在香梨酒发酵过程中的作用，以期为果酒酿造工艺改进提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
库尔勒香梨：购买于新疆塔城市金盛超市；果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；柠檬酸、碳酸氢钠、异抗坏血酸、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（10 000 U）：山东济宁和美生物工程有限公司；没食子酸（纯度≥98.0%）：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-2600紫外分光光度计：日本岛津公司；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂；QP2010plus型气质联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）仪：日本岛津公司；WAY-2S数字阿贝折射仪：广州市爱宕科学仪器有限公司；D-55122电位滴定仪：德国Mainz公司；ZXSD-1160生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；HR1871榨汁机：飞利浦（中国）投资有限公司；BL-206-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科技仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 香梨酒的酿造工艺流程及操作要点
操作要点：选择新鲜成熟的香梨，清水洗净后去核、切块，用榨汁机将香梨打浆，添加0.2%的异抗坏血酸护色，护色后的梨汁加入3‰果胶酶混匀，38 ℃果胶酶酶解10 h后，85 ℃进行灭酶处理10 min。用8层纱布过滤，得到澄清梨汁备用，分成4组，分别添加0、10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L的GSH，共4种香梨酒样，以不添加GSH 的香梨酒空白作为对照组（CK）；添加10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L GSH的香梨酒分别编号为GSH-10、GSH-20、GSH-30。添加蔗糖将香梨汁糖度调节至20°Bx，用0.5 mol/L 的碳酸氢钠溶液将香梨汁pH值调至为5.5，取2 g果酒专用酵母添加到30 mL质量分数为5%的蔗糖溶液中，搅拌均匀，在30 ℃条件下活化约30min，至糖水中出现大量的小气泡为止。取0.06 g/mL活化酵母液5 mL接种至香梨汁中，使用纱布封闭瓶口，置于25 ℃生化培养箱中发酵，定期测定酒精度，待酒精度不再升高，终止发酵。
1.3.2 总酚含量的测定
总酚含量的测定采用福林酚比色法。取稀释20倍的香梨酒0.5 mL加入至试管中，并在试管中按顺序加入0.5 mL蒸馏水、0.5 mL福林酚试剂和1.5 mL质量分数7.5%碳酸钠溶液，在20 ℃条件下避光放置120 min后于波长765 nm处测定其吸光度值。以没食子酸标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=0.031 4x+0.022 7（R2=0.993 6）。根据标准曲线回归方程计算样品中总酚含量（以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示）。
1.3.3 颜色指数测定
颜色指数的测定参考WEBBER V等[10]的方法，取4 mL香梨酒样，加入8 mL无水乙醇，室温静置10 min后，用离心机于4 000 r/min下离心15 min，吸取上清液在波长420 nm处测定吸光度值（A420nm），以吸光度值表示其颜色指数。吸光度值越大，表明其颜色越深。
1.3.4 挥发性组分的检测
挥发性组分的测定采用气质联用法。将1 mL香梨酒样品置于20 mL顶空瓶内，调节温度为50 ℃，平衡40 min，将萃取头插入顶空瓶中萃取30 min后拔出萃取头并置于250 ℃的进样口中解吸2 min。
气相色谱条件：DB-WAX石英毛细管柱（30m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：柱温箱初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min上升到200 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃，载气为氦气（He），流速1 mL/min，不分流进样。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，传输线温度250 ℃，采用全扫描模式采集信号，扫描范围35～500 m/z。
1.3.5 香梨酒感官评价
香梨酒感官评价参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]和GB/T 10220—2012《感官分析方法学总论》[12]，感官评价标准见表1。由10名专业感官评价员组成品评小组对样品的外观、香气、口感和典型性4个方面进行评价，以优、良、合格、不合格为评价等级，采用模糊数学法对其结果进行分析，满分100分。
表1 香梨酒感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fragrant pear wine
续表
评价因素集U={U1，U2，U3，U4}，其中U1，U2，U3，U4分别代表评价指标为外观、香气、口感、典型性。
评价评语集V={V1，V2，V3，V4}，其中V1，V2，V3，V4分别代表评价的评分为优、良、合格、不合格。
模糊关系综合评判集Y=X×R，其中X为权重集，经专家评议X={X1，X2，X3，X4}={0.2，0.3，0.3，0.2}，R为模糊矩阵，且R=U×V。将评价评语集中的优、良、合格和不合格四个等级分别赋值为100分、80分、70分和60分，则综合评判集Y与对应评语等级分数的乘积之和为该产品的最终得分。
1.3.6 基本理化指标的测定
可溶性固形物（soluble solids，TSS）采用手持糖度仪；pH值采用pH计；还原糖、总酸和酒精含量参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.7 数据分析
实验数据运用Origin 9.0和SPSS 22.0软件进行分析。除特殊说明外，每个样品测定均重复三次，实验结果以“平均值±标准偏差”表示。显著性分析使用Duncan检验（P＜0.05为显著差异），显著性差异结果采用标记字母法表示。
2 结果与分析
2.1 不同谷胱甘肽添加量对香梨酒基本理化指标的影响
表2 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的基本理化指标
Table 2 Basic physicochemical indexes of pear wine with different glutathion addition
注：同一列数字带有相同的小写上标字母表示无显著差异（P＞0.05）。
不同谷胱甘肽添加量香梨酒的基本理化指标结果见表2。由表2可知，酒精度在10.14%vol～10.24%vol之间，且无显著性差异（P＞0.05），这可能是GSH 并不参与酒精发酵过程中乙醇的代谢[6]，香梨酒的其他理化指标（可溶性固形物、总糖含量、pH值和滴定酸）基本不受GSH添加量的影响，这可能是因为添加量30%以内的GSH对酵母菌的生长代谢无显著影响[10]。梁晓芳等[13]研究了谷胱甘肽的添加对干白葡萄酒的基本理化指标的影响，结果显示在35 d加速氧化条件下，葡萄酒中添加0.05 mg/L的GSH可保护果酒的可溶性固形物和还原糖含量。在工业应用中，GSH的添加不会引起果酒基本理化指标的改变，GSH具有还原性可以保护多酚物质满足生产的要求。
2.2 不同谷胱甘肽添加量对香梨酒总酚含量和颜色指数的影响
不同谷胱甘肽添加量香梨酒总酚含量和颜色指数见图1。由图1可知，香梨酒总酚含量随GSH添加量（0～20mg/L）的增大而升高，当GSH添加量＞20 mg/L之后趋于平稳。香梨酒总酚含量的升高是因为香梨酒酿造过程中酚类化合物会发生酶促氧化和化学氧化（非酶氧化）两种氧化形式。在添加GSH之前的榨汁过程中，果汁中的酚类化合物就已经多酚氧化酶催化发生酶促氧化反应，所以GSH的添加几乎不能抑制多酚的氧化。但GSH具有还原性，可以和果酒中的氧化物结合，避免黄烷醇类、黄酮醇类和羟基肉桂酸类等多酚物质发生化学氧化[13]。当GSH添加量较少时，添加的GSH全部发生反应，此时GSH的含量不足以平衡氧化物；随着添加量的增加，GSH出现过剩现象，在保证氧化物质被消耗完后仍然剩余，因此总酚含量不发生显著性变化。
图1 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的总酚含量和颜色指数
Fig.1 Total phenolic contents and color indexes of fragrant pear wine with different glutathion addition
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1亦可知，当GSH添加量＜20 mg/L之前，香梨酒颜色指数（A420nm值）从0.31降低至0.18。可能是因为GSH阻止了果酒的非酶促褐变。酒中的酚类物质可以被氧化为醌类化合物，由于邻醌类物质的化学性质不稳定，醌类物质相互聚合或与蛋白质、氨基酸、酚类等发生聚合生成深色聚合物，导致香梨酒的褐变。GSH能与醌类化合物发生聚合反应，生成即不会被氧化也没有颜色的产物，从而阻断褐变过程，抑制果酒的褐变[13]。
2.3 不同谷胱甘肽添加量对香梨酒挥发性组分的影响
香梨酒发酵过程中，不同GSH添加量对果酒挥发性组分的影响结果见表3。
表3 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的挥发性组分
Table 3 Volatile compounds of pear wine with different glutathion addition
续表
注：同一行数字不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表3可知，随着GSH添加量在0～30 mg/L范围内增加，果酒中异戊醇、异丁醇、正辛醇和苯乙醇的含量显著增加（P＜0.05），分别增加了21.80%、24.88%、55.11%、30.25%。这可能是当酵母细胞处于还原状态时，还原型辅酶I可将醛类还原成醇类；处于氧化状态时，氧化型辅酶I可将一些醇类物质氧化为醛或挥发性羧酸。除此之外，Ehrlich反应会将氨基酸被分解成特定的高级醇，从而增加醇类的相对含量[14]。
酯类香气是香梨酒中最重要的香气成分之一。果酒中的酯类物质主要来源于酒精发酵过程中的酯化反应和酵母的次级代谢，但也有一小部分来自于香梨汁。在本研究中，酯类香气特别是乙酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、顺-2-反-4-癸二烯酸乙酯等是主要的香气物质。己酸乙酯、苯乙酸乙酯和顺2-反-4-癸二烯酸乙酯可赋予香梨酒水果香气，能够对果酒品质起到积极作用[15]，它们的含量随GSH添加量的增大而增加。贾娟等[3]认为，香梨的特征风味物质为不饱和脂肪酸的酯类（如：顺-2-反-4-癸二烯酸甲酯、乙酯等），GSH的添加能使得香梨酒保留浓郁的梨香。但是部分酯类在添加GSH后含量减少，可能是由于酒精发酵过程中还原状态下的GSH抑制了醛类氧化成酸类，从而减少了醇和酸酯化反应的机会[15-17]。
香梨酒中检测出了辛酸、己酸、1-甲基-2-羟基苯甲酸3种酸类香气。在低浓度时，挥发性酸类香气会增加果酒的复杂性，而在超过它们的阈值时，它们会对果酒香气产生负面影响。不同添加量GSH的香梨酒中的酸类含量均低于对照组。
萜烯类香气主要来自于水果本身，可以增加果酒的特色风味。萜烯类香气的阈值较低，它们可以直接或通过协同作用赋予果酒花香气味。萜品油烯、α-法尼烯、香茅醇、芳樟醇分别赋予果酒呈芳香的松木香气、柠檬香味、微带甜的柑橘风味和玫瑰香气。GSH的添加显著增加了萜烯类物质的含量（P＜0.05）。这可能是因为萜类物质在发酵过程中容易被相应的萜类的氧化物取代，而GSH在一定程度上可以抑制这种氧化反应的发生[16-17]。
香梨酒中检测出壬醛、糠醛、癸醛、苯甲醛4种醛类物质，在低浓度下，苯甲醛会给果酒带来令人愉悦的果香。GSH的添加显著降低了醛类的含量（P＜0.05），这可能是因为GSH的还原性有利于醛还原为醇，它的亲核残基还能够与醛形成加合物。同样，GSH的还原性抑制了醇类氧化成为酮类，可显著降低酮类的含量[17-18]。
2.4 模糊数学法分析感官评价结果
根据表1将10位感官评价员的评分结果进行汇总，建立4种香梨酒的模糊数学矩阵RCK、RGSH-10、RGSH-20、RGSH-30如下：
模糊数学感官评价法能综合考虑多种评定因素，使得评定结果较为客观[19-20]。根据模糊关系建立综合评判集见表4。将评价评语集中的优、良、合格和不合格四个等级分别赋值为100分、80分、70分和60分，综合评判集与对应评语等级的分数乘积之和为该产品的最终得分。由此可计算得CK、GSH-10、GSH-20、GSH-30最终得分为84.6分、85.8分、88.1分、88.0分。因此，香梨酒感官评价结果为GSH-20＞GSH-30＞GSH-10＞CK。总的来说，添加20 mg/L的GSH香梨酒综合感官评价得分最高为88.1分。
表4 香梨酒的感官综合评价结果
Table 4 Senory evaluation results of fragrant pear wines
3 结论
不同GSH添加量对香梨酒的基本理化指标基本没有影响，但总酚含量随着GSH添加量的增大而增大（231.33～312.67 g/mL），GSH自身的抗氧化能力可以保护多酚被氧化，抑制果酒颜色指数上升（0.31～0.18）。GSH的增加可影响香梨酒挥发性香气的组成，使得大多数的醇类、酚类和萜烯类香气含量有所升高，酯类、醛酮类含量下降，香梨特征风味增强，香气更加柔和。数学模糊法感官评价结果显示，GSH添加量为20 mg/L时，香梨酒的感官评分最高为88.1分，酒体的外观，口感，香气更适合消费者。在香梨酒发酵阶段，适量GSH的添加可以减少二氧化硫的使用，改善果酒香气成分和果酒品质。但同时应该考虑成本和过量添加对果酒品质的不利影响，这为香梨果酒的工业生产提供一定的参考。
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