锌是人体中许多蛋白质、金属酶和催化辅助因子的组成部分[1]，也是影响新陈代谢和生长发育的重要元素之一[2]。最新研究表明，富含锌的食物可以改善睡眠质量[3]，但缺锌和锌摄入过量都会对人体健康造成危害[4-5]。酵母菌是一种单细胞真核微生物，属于酵母属，是人类利用最早、最广泛的纯天然营养型微生物[6]，也是天然的营养宝藏和理想的生物载体[7-8]，含有多种人体必需氨基酸、维生素和生理活性物质[9-11]，并且具有较强富集微量元素的能力。ZHANG S Q等[12-13]研究表明，硫化锌、葡萄糖酸锌和酵母锌在血浆和组织水平上具有等效的生物利用度，但酵母锌在体内的吸收和保留作用与硫化锌和葡萄糖酸锌相比具有统计学上的意义，而且在提高锌的吸收率的同时还可以降低对肠胃的刺激作用[14-16]。
富锌酵母是在酵母菌生长的特定条件下加入无机锌从而得到富锌能力强的酵母菌株。作为一种补锌的安全原料，富锌酵母有广泛的应用范围，因此引起各个领域研究人员的关注。石玉城等[17]从法国面包酵母中获得了具有较高产率的富锌酵母菌株，含锌量达4 000～15 000 μg/g；曹源伟等[18]从啤酒酵母中驯化筛选出具有耐铁锌能力的富铁一锌酵母，该酵母的生物量可达13.68 mg/mL，铁元素的转化率可达71.56%，锌元素的转化率可达59.91%；王战勇等[19]从啤酒酵母中获得富锌酵母，其生物量达到（8.712±1.033）g/L的同时，锌含量可达（7.890±0.802）mg/g；关转飞等[20]以啤酒废酵母为原料，制备富锌酵母，并确定了其最佳工艺条件；YANG C等[21]利用酿酒酵母对环境元素进行富集，获得了富铁锌酵母，并且研究了pH值、接种量和培养时间对酵母富集铁锌的影响。但是目前酵母富锌量不高，紫外诱变、化学、诱变剂诱变等方法存在辐射性和毒性的局限，因此对酵母富锌条件需要进一步研究。由此可见，富锌酵母的驯化，得到较高富锌量的酵母菌，在微生物学领域具有重要的学术意义，在食品和医药领域也具有广阔的应用前景。
本研究以实验室前期从传统发酵法制备的面包坯中筛选得到的性能较好的酵母DLY28为出发菌株，通过锌元素驯化获得一株优良耐锌酵母，并通过单因素试验及响应面试验对其富锌培养基进行优化，为微生物方法富集微量元素以及富锌食品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
酵母菌DLY28：由东北林业大学食品科学与工程实验室保存。
1.1.2 试剂
硫酸锌、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、四硼酸钠（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；无水乙醇、尿素（均为分析纯）：天津永大化学试剂有限公司；牛肉膏（生化试剂）、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；1 000 mg/L锌标准溶液：天津市光复精细化工研究所；1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（1-（2-pyridinylazo）-2-naohthalenol，PAN）（分析纯）、胰蛋白胨（生化试剂）：上海源叶生物有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L。YPD固体培养基中添加琼脂20 g/L。115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
H/T20MM台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；HZQ-F全温振荡培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；DH6000A型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；DY04-13-44-00立式压力蒸汽灭菌器筒：上海东亚压力容器制造有限公司；722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；FD-IA-80冷冻干燥机：上海比朗仪器有限公司；VE-10LH-EII综合型超纯水机：宏森环保科技有限公司；FA2004型电子分析天平：上海良平仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌DLY28生长曲线的测定
在无菌条件下，采用接种环取酵母菌DLY28于YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h。按1%（V/V）的接种量将活化的酵母菌液接种于100 mL YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h。以未接菌的YPD液体培养基为空白，测定菌液的OD600nm值，前20 h每隔4 h测定一次，之后每隔2 h测定一次，直到OD600nm值变化平稳为止，以培养时间（x）为横坐标，OD600nm值（y）为纵坐标绘制酵母菌的生长曲线。
1.3.2 固体平板初次驯化酵母菌DLY28[2]
选取16个酵母菌DLY28单菌落，分别命名为S1～S16，接种于YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养15 h，培养菌液按1%（V/V）的接种量转接到YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养15 h，稀释1 000倍后，吸取3 μL滴加于含不同质量浓度锌（0 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L）的YPD固体平板上，30 ℃恒温培养1～2 d，观察菌株的生长状况。
1.3.3 液体培养基二次驯化酵母菌DLY28[2]
从YPD固体平板中，选取耐800 mg/L锌的酵母菌接种于YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养15 h，按1%（V/V）的接种量接种于含质量浓度1000 mg/L锌的YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h后取样，用722型可见分光光度计在波长600 nm处测定菌液的OD600nm值。
1.3.3 驯化酵母菌DLY28种子液的制备
将驯化的酵母菌接种于100 mL YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h制成种子液。
1.3.4 富锌酵母培养基优化单因素试验
碳源种类及质量浓度对酵母锌吸附能力的影响：以YPD液体培养基为基础培养基，以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖作为碳源，其余组分和质量浓度不变，按1%（V/V）的接种量将驯化酵母菌种子液接种于液体培养基，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h后，测定菌液的OD600nm值，筛选出最佳碳源；将最佳碳源质量浓度调整为40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L、140 g/L，添加300 mg/L硫酸锌，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h，测定生物量（OD600nm值）和锌吸附量，筛选最佳碳源质量浓度。
氮源种类及质量浓度对酵母锌吸附能力的影响：以蔗糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L的液体培养基为基础培养基，以20 g/L的蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素作为氮源，其余成分和质量浓度不变，按1%（V/V）的接种量将驯化酵母菌种子液接种于液体培养基，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h后，测定菌液的OD600nm值，筛选出最佳氮源；将最佳氮源质量浓度调整为10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L，添加300 mg/L硫酸锌，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h，测定OD600nm值和锌吸附量，筛选最佳氮源质量浓度。
培养基锌质量浓度对酵母锌吸附能力的影响：在蔗糖80 g/L、胰蛋白胨25 g/L、酵母浸粉10 g/L的液体培养基中添加硫酸锌，使培养基中的锌质量浓度分别为100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L，按1%（V/V）的接种量将驯化酵母菌种子液接种于液体培养基，30 ℃、200 r/min条件下培养48 h后，测定OD600nm值及锌吸附量。
1.3.5 富锌酵母DLY28培养基优化响应面试验
以锌吸附量（Y）为响应值，以蔗糖质量浓度（A）、胰蛋白胨质量浓度（B）、锌质量浓度（C）为考察因素，进行3因素3水平Box-Behnken响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 富锌酵母培养基优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for zinc-enriched yeast medium optimization
1.3.6 测定方法
锌含量的测定：按照参考文献[22]的方法测定锌含量。
锌吸附量的计算公式如下：
锌吸附量（mg·g-1）=
式中：A1为初始培养基中锌质量浓度，mg/L；A2为富锌后培养基中剩余的锌质量浓度，mg/L；B为菌体干质量，g/L。
菌体干质量的测定：将菌液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，菌体用无菌水清洗三次，将装有菌体的离心管放入冷冻干燥机中，-18 ℃预冷24 h，-50 ℃、6 Pa条件下冷冻干燥24 h后，取出干燥的菌体，采用分析天平测定菌体干质量。
2 结果与分析
2.1 酵母菌DLY28生长曲线的测定
酵母菌DLY28的生长曲线见图1。
图1 酵母菌DLY28的生长曲线
Fig.1 Growth curve of yeast DLY28
由图1可知，酵母菌生物量呈现逐渐增加的趋势，符合典型的逻辑斯蒂S型生长曲线，0～8 h为迟滞期，8～20 h为对数生长期，20 h以后为稳定期。处于对数生长期的菌体生长旺盛、代谢活性强，因此，本实验选择培养15 h的酵母进行耐高质量浓度锌能力的驯化[23]。
2.2 高质量浓度锌环境对酵母菌DLY28的驯化
2.2.1 固体平板初次驯化
16株酵母菌经初次驯化后，生长情况见图2。由图2可知，随着锌质量浓度的增高，锌对16株酵母菌生长的抑制作用增加，其中酵母菌S6、S7、S8、S10、S11、S12、S15生长较好，说明耐锌能力较好，因此，选择这7株酵母菌进行二次驯化。
图2 锌质量浓度对16株酵母菌生长的影响
Fig.2 Effect of zinc concentrations on the growth of 16 yeast strains
2.2.2 液体培养基二次驯化
7株酵母菌经二次驯化后，生物量测定结果见图3。
图3 7株酵母菌二次驯化的生长情况
Fig.3 Growth of 7 yeast strains after secondary domestication
由图3可知，酵母菌S7在锌质量浓度为1 000 mg/L的YPD液体培养基中生物量最高，由此可知，酵母菌S7的耐锌能力最强，因此，选择酵母菌S7进行进一步研究。
2.3 富锌酵母菌S7培养基优化单因素试验
2.3.1 培养基碳源的筛选
不同碳源对酵母菌S7生长的影响见图4。
图4 不同碳源对酵母菌S7生长的影响
Fig.4 Effect of different carbon source on the growth of yeast S7
由图4可知，在以蔗糖为碳源的培养基中酵母菌S7的生物量最高，OD600nm值达到1.15，其余生物量由高到低的碳源依次为麦芽糖、葡萄糖、果糖，分析原因可能是由于菌株对果糖的转运或代谢存在障碍，造成碳源利用率低、菌株增殖能力较差[8]，也有可能是酵母基因组中有蔗糖水解酶基因，具有利用蔗糖作为碳源的能力[24]。石玉城等[17]研究发现，富锌酵母的最佳碳源为蔗糖，结果与本实验相似。因此，选择蔗糖作为培养基的最佳碳源。进一步考察蔗糖质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响，结果见图5。
图5 蔗糖质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响
Fig.5 Effect of sugar concentration on the growth and zinc adsorption of yeast S7
由图5可知，当蔗糖质量浓度＜80 g/L之前，酵母菌S7的锌吸附量和生物量均随着蔗糖质量浓度的增加而增加；当蔗糖质量浓度为80 g/L时，两者同时达到最大值，分别为11.35 mg/g、1.319；当蔗糖质量浓度＞80 g/L之后，酵母菌S7的锌吸附量及生物量随着蔗糖质量浓度的增加而减少，分析原因可能是碳源质量浓度过高，酵母菌S7新陈代谢速度增加，促进代谢产物的不断积累，导致酵母菌的繁殖受到影响[25]。所以，确定蔗糖最佳质量浓度为80 g/L。
2.3.2 培养基氮源的筛选
不同氮源对酵母菌S7生长的影响见图6。
图6 不同氮源对酵母菌S7生长的影响
Fig.6 Effect of different nitrogen source on the growth of yeast S7
由图6可知，在以胰蛋白胨为氮源的培养基中酵母菌S7的生物量最高，OD600nm值达到1.365，其余生物量由高到低的氮源依次为蛋白胨、牛肉膏、尿素。胰蛋白胨，又称胰酪蛋白胨、胰酶消化酪蛋白胨，是一种优质蛋白胨，具有更丰富的营养，氮以氨基酸和肽类等小分子形式存在，更利于菌体吸收利用[26]。因此，选择胰蛋白胨作为培养基的氮源。进一步考察胰蛋白胨质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响，结果见图7。
图7 胰蛋白胨质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响
Fig.7 Effect of tryptone concentration on the growth and zinc adsorption of yeast S7
由图7可知，当胰蛋白胨质量浓度＜25 g/L之前，酵母菌S7的锌吸附量和生物量均随胰蛋白胨质量浓度的增加而增加；当胰蛋白胨质量浓度为25 g/L时，两者同时达到最大值，分别为12.03 mg/g、1.406；当胰蛋白胨质量浓度＞25 g/L之后，酵母菌S7的锌吸附量及生物量均随着胰蛋白胨质量浓度的增加而减少，这是由于过高的底物浓度，会对酵母细胞产生高的渗透压力，影响酵母的生长与代谢，甚至完全抑制酵母的生长[27]。所以，确定最佳胰蛋白胨质量浓度为25 g/L。
2.3.3 培养基锌质量浓度对酵母锌吸附能力的影响
锌质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响见图8。
图8 锌质量浓度对酵母菌S7生长及锌吸附量的影响
Fig.8 Effect of zinc concentrations on the growth and zinc adsorption of yeast S7
由图8可知，当锌质量浓度＜400 mg/L之前，酵母菌S7的锌吸附量和生物量均随着锌质量浓度的增加而增加，分析其原因可能是一定量的锌促进了细胞生长；当锌质量浓度为400 mg/L时，两者皆达到最大，分别为15.78 mg/g、1.426；当锌质量浓度＞400 mg/L之后，酵母菌S7的锌吸附量和生物量都随锌质量浓度的增加而减少。分析原因可能是锌离子是生物体内很多生物酶的辅助因子，随着锌含量的增加而促进生长发育，但酵母菌所能耐受的锌浓度和渗透压有限，锌离子质量浓度增加到一定程度反而限制了其生长[20]。所以，确定最佳锌质量浓度为400 mg/L。
2.4 富锌酵母菌S7培养基优化响应面试验
以蔗糖质量浓度（A）、胰蛋白胨质量浓度（B）和锌质量浓度（C）作为自变量，锌吸附量（Y）为响应值，利用响应面法[28]设计Box-Behnken试验，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken tests
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of the regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
利用Design-Expert V8.0.6软件对表2中数据进行回归拟合分析，得到自变量与锌吸附量的二次多项回归方程为Y=18.52+1.17A+0.93B+0.41C+0.43AB-1.60AC+1.10BC-4.96A2-3.90B2-4.87C2。
由表3可知，模型的P值＜0.000 1，极显著，失拟项P值＞0.05，不显著，表明回归模型可靠。决定系数R2值为0.985 2，调整决定系数R2Adj值为0.966 1，均＞0.9，说明拟合程度较好，实验误差小。由回归模型和方差分析可知，一次项A、B和交互项AC、BC对酵母菌S7锌吸附量的影响显著（P＜0.05）；二次项A2、B2、C2对锌吸附量的影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
蔗糖质量浓度、胰蛋白胨质量浓度、锌质量浓度3个因素之间交互作用对酵母菌S7锌吸附量的影响见图9。圆形的等高线表示两因素的交互作用不显著，而成椭圆形或马鞍形则表示两因素有显著的交互作用。
图9 各两因素交互作用对酵母菌S7锌吸附量影响的响应面及等高线
Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on zinc adsorption of yeast S7
由图9可知，蔗糖质量浓度（A）和胰蛋白胨质量浓度（B）等高线图呈圆形，表明两因素间的交互作用不显著。蔗糖质量浓度（A）和锌质量浓度（C）、胰蛋白胨质量浓度（B）和锌质量浓度（C）等高线呈椭圆形，表明两因素之间交互作用较显著，与方差分析结果一致。
利用Design-Expert V8.0.6软件，求出回归模型的极值点，得到富锌酵母菌S7的最优培养基组分为蔗糖质量浓度82.4 g/L、胰蛋白胨质量浓度25.7 g/L、锌质量浓度404.0 mg/L，模型预测的最高锌吸附量为18.66 mg/g。为了便于试验操作，将最优培养基组成修订为蔗糖质量浓度82 g/L、胰蛋白胨质量浓度26 g/L、锌质量404 mg/L。在此最佳水平下进行3次验证试验，酵母菌S7锌吸附量为18.79 mg/g，生物量（OD600nm值）为1.49，与预测值接近，说明该模型可以用于优化富锌酵母培养条件。
3 结论
本研究以实验室保存的酵母DLY28为研究对象，通过两次驯化后得到的一株耐锌酵母S7，采用单因素试验及响应面法确定其富锌最优培养基组分为蔗糖质量浓度82 g/L，胰蛋白胨质量浓度26 g/L，锌质量浓度404 mg/L，在此优化条件下，富锌酵母S7的锌吸附量达到18.79 mg/g，生物量（OD600nm值）为1.49。
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