葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶，能利用氧分子作为电子受体催化β-D-葡萄糖氧化成为D-葡萄糖酸-δ-内酯和H2O2[1-2]。GOD是一种重要的商业用酶，广泛应用于医药、纺织、食品、饲料、生物能源等多个领域[3-8]。GOD对多种病原菌如沙门氏菌（Salmonellainfantis）、金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、空肠弯杆菌（Campylobacter jejuni）、单增李斯特菌（Listeria monocytogens）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等有很好的拮抗作用[9]，可作为防腐剂和抗氧化剂，其杀菌效果比化学抑菌剂更具备安全性。
GOD广泛存在于动植物、微生物体内，但动植物组织中含量有限。微生物具有来源广、生长周期短等优点，是GOD工业化生产的主要方式。目前用于生产的菌株主要有曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）[10]真菌，此外，研究发现拟青霉属、胶霉属、帚霉属以及一些酵母菌和细菌也具有产葡萄糖氧化酶的能力[11-13]。GOD目前存在着分离纯化成本高、稳定性及酶活性较差等问题[14]。黑曲霉和青霉因其产酶能力强，易于规模化而被广泛用于生产。但发酵过程中，有大量杂蛋白生成，且产品温度稳定性在20～50 ℃[15]，导致质量和价格差异较大。因此，需要进一步筛选性能优良菌株，来提升国内葡萄糖氧化酶酶制剂质量和市场竞争力[16]。
土壤中微生物资源丰富，本研究从土壤和果皮样品中筛选产葡萄糖氧化酶菌株，通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其所产葡萄糖氧化酶酶学性质进行初步研究，以期得到产胞外葡萄糖氧化酶酶活力高且热稳定性较好的优良菌株，为进一步构建新型产葡萄糖氧化酶工程菌株提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
土壤样品：分别采集于内蒙古甜菜地、河南长垣黄河滩地葡萄根际、云南昆阳磷矿土壤；葡萄样品：采自市售葡萄。采用多点混合采样的方法[17]，土壤采集深度3～10 cm，混合均匀后将其装入无菌袋中，0～4 ℃保存。
1.1.2 培养基
初筛培养基[18]：蛋白胨3.0 g，葡萄糖80.0 g，脱氧胆酸钠0.2 g，KH2PO4 0.2 g，CaCO3 3.5 g，（NH4）2HPO4 0.4 g，可溶性淀粉10.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KI 1.7 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃条件下高压蒸汽灭菌25 min。
发酵培养基[19]：蛋白胨3.0 g，葡萄糖80.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃条件下高压蒸汽灭菌25 min。
马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基[19]：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃条件下高压蒸汽灭菌25 min。
1.1.3 主要试剂
脱氧胆酸钠（分析纯）：上海索莱宝生物科技有限公司；靛蓝胭脂红：上海源叶生物有限公司；2×Es Taq Master Mix：北京康为世纪生物科技有限公司；真菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：美国Omega Bio-Tek公司；菌株18S rDNA基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增通用引物NS1、NS8：北京六合华大基因科技有限公司；DM2000 DNA Marker：北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉（均为生化试剂）：英国Oxoid公司；琼脂糖生化试剂：上海贝晶生物技术有限公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Axio Image M2全电动正置荧光显微镜：德国zeiss公司；德国Thermo公司；DYY-6C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；DRP-9052型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统：美国Bio-Rad公司；Vortex-Genie2可调速漩涡混合器：美国SI公司；QYC-2012C恒温摇床：上海福玛实验设备有限公司；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪、Multifuge X1R离心机：美国THERMO公司；DK-8D恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；SX-500立式压力蒸汽灭菌锅：日本TOMY公司；Thermoblock梯度PCR仪：德国Biometra公司。
1.3 方法
1.3.1 产葡萄糖氧化酶菌株的筛选
初筛：称取10 g样品，加入装有8颗玻璃珠及90 mL生理盐水的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min条件下振荡培养30 min。采用梯度稀释法，分别取200 μL不同梯度的样品稀释液涂布到初筛培养基，在28 ℃条件下培养至菌落长出，放置4 ℃冰箱，观察显色。挑取初筛培养基上呈现蓝色的菌株在PDA培养基上进行分离纯化，得到单菌落。
复筛：将初筛得到的菌株接种到液体发酵培养基中，在25 ℃、180 r/min条件下培养3～7 d，取适量发酵液离心，上清即为粗酶液，采用靛蓝胭脂红褪色分光光度计法[20]测定葡萄糖氧化酶活力。
葡萄糖氧化酶活力定义：在50 ℃、pH 6.0条件下，每分钟催化氧化产生1 μg过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U/mL）。
1.3.2 高产葡萄糖氧化酶菌株的鉴定
形态观察：将高产葡萄糖氧化酶的菌株接种于PDA培养基上，在28 ℃条件下培养48～72 h，观察其菌落形态、边缘、颜色、菌丝长度等；显微镜下观察孢子及菌丝形态。
分子生物学鉴定：采用Omega真菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采取通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）、NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'）PCR扩增18S rDNA序列。PCR扩增体系（25 μL）：Es Taq Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，NS1、NS8上下游引物各1 μL，超纯水9.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。将PCR扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，送去北京六合华大基因科技有限公司进行测序。测序结果提交至美国国立生物技术信息中心进行BLAST比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的18S rDNA序列，利用MEGA6软件中的邻接法构建系统发育树。
1.3.3 葡萄糖氧化酶酶学性质研究
最适温度及其温度稳定性：分别设置30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃温度梯度，测定粗酶液在不同温度下的酶活性，并测定粗酶液分别在不同温度下保温30 min后的剩余酶活力。设定最大酶活为100%，其他酶活值与之比值，计算相对酶活。确定酶的最适反应温度及温度稳定性。
最适pH及pH稳定性：配制pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲液，绘制不同pH条件下过氧化氢标准曲线。测定不同pH缓冲液稀释粗酶液酶活力值，并且在4 ℃条件下不同pH缓冲液体系放置24 h后测定剩余酶活。计算相对酶活值。
金属离子对酶活性的影响：在反应体系中分别加入2 μmol/mL的Na+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Co2+、Fe2+、K+、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），测定酶活，以未加金属离子的酶活为100%，计算相对酶活值。
2 结果与分析
2.1 产葡萄糖氧化酶菌株的筛选
通过初筛培养基分离筛选得到3株产葡萄糖氧化酶的菌株（图1），命名为CY-12、KY-16、PT-22。
将初筛得到的3株菌株接种于液体发酵培养基进行复筛，结果见表1。由表1可知，3株菌均有产葡萄糖氧化酶活性，且在培养初期随着培养时间的延长，其葡萄糖氧化酶活性升高，至发酵第3天进入产酶高峰期，第4天后随着培养基中营养物质的消耗，产酶活性都有不同程度的下降。其中菌株CY-12葡萄糖氧化酶活性最高，发酵第3天达到194.69 U/mL，并且产酶活性较稳定，在发酵第6天仍然保持32.14%的酶活，因此，选择菌株CY-12为出发菌株。
图1 产葡萄糖氧化酶菌株的初筛结果
Fig.1 Results of preliminary screening of glucose oxidase-producing strain
表1 产葡萄糖氧化酶菌株的复筛
Table 1 Secondary screening of glucose oxidase-producing strain
2.2 产葡萄糖氧化酶菌株的鉴定
2.1.1 形态观察
图2 高产葡萄糖氧化酶菌株CY-12的菌落（a）及细胞（b）形态
Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of high glucose oxidase producing strain CY-12
由图2可知，产葡萄糖氧化酶菌株CY-12在PDA平板上菌落正面灰绿色，背面墨绿色，圆形、干燥、表面平坦，中心突起，边缘绒毛状，没有分泌物。在显微镜下观察菌丝少分支。分生孢子梗长，暗色，直立，顶部常形成分枝，单生或簇生。分生孢子暗色，1或2个细胞，形状、大小不一，有些呈典型的柠檬状。根据菌落和形态特征，初步鉴定该菌株属于枝孢属（Cladosporium sp.）。
2.1.2 分子生物学鉴定
以提取的菌株CY-12的DNA为模板，以NS1、NS8为引物PCR扩增18S rDNA序列，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。
图3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products
M为DNA Marker。
由图3可知，PCR扩增产物碱基长度为1 700 bp左右，与预期结果相符。PCR扩增产物经过纯化后委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序，利用MEGA6软件中的NJ法构建系统发育树，基于18S rDNA基因序列菌株CY-12的系统发育树见图4。
图4 基于18S rDNA基因序列菌株CY-12的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain CY-12 based on 18S rDNA gene sequences
由图4可知，菌株CY-12与Cladosporiumiridis CBS138.40T聚于同一分支，相似性最高。结合形态观察结果，确定菌株CY-12为枝孢属（Cladosporium sp.）。
2.3 菌株CY-2产葡萄糖氧化酶酶学性质研究
2.3.1 不同温度对葡萄糖氧化酶活性的影响
由图5可知，随着反应温度的升高，酶活性呈先升高后下降的趋势，当反应温度为60 ℃时，酶活力最高，因此确定该酶的最适反应温度为60 ℃。
由图5可知，菌株CY-12所产的葡萄糖氧化酶在50～60 ℃保温30 min，剩余酶活力均能保持在90%以上；70 ℃保温30 min有85.97%的剩余酶活；80 ℃保温30 min仍有72.93%的剩余酶活。证明该酶有较强的耐高温性能且在30～80 ℃能保持较好的温度稳定性。
图5 温度对菌株CY-12所产葡萄糖氧化酶活力及稳定性的影响
Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of glucose oxidase produced by strain CY-12
2.3.2 不同pH值对葡萄糖氧化酶活性的影响
图6 pH值对菌株CY-12所产葡萄糖氧化酶活力及稳定性的影响
Fig.6 Effect of pH value on the activity and stability of glucose oxidase produced by strain CY-12
由图6可知，菌株CY-12所产的葡萄糖氧化酶在pH值＜5.0条件下相对酶活力低于10%，pH值＞5.0以后迅速升高，pH值为6.0时酶活力最高，随着pH值的继续升高酶活迅速降低，当pH值为7.0时，相对酶活仅剩31.44%。因此，确定该酶的最适反应pH值为6.0。
由图6可知，在pH值为3.0和7.0条件下处理24 h后，相对酶活分别为26.57%、29.79%；在pH值4.0～6.0条件处理24h后，相对酶活力均能保持在75%以上；在pH值6.0条件处理24h后，相对酶活＞90%。证明该酶在中性偏酸条件下较为稳定。
2.3.3 不同金属离子对葡萄糖氧化酶活性的影响
图7 金属离子对菌株CY-12所产葡萄糖氧化酶活力的影响
Fig.7 Effect of metal ions on the activity of glucose oxidase produced by strain CY-12
由图7可知，Cu2+对酶活有明显的激活作用，相对酶活达到151.13%；Co2+对酶活有明显的抑制作用，相对酶活降至86.66%；其他离子对酶活作用不明显。
3 结论
经过初筛、复筛，从河南长垣黄河滩地葡萄根际土壤中筛选得到1株高产胞外葡萄糖氧化酶的菌株CY-12，其葡萄糖氧化酶活力最高可达194.69 U/mL。通过形态观察和分子生物学技术鉴定，鉴定菌株CY-12为枝孢属（Cladosporium sp.）。该葡萄糖氧化酶酶促反应的最适反应温度为60 ℃，在30～80 ℃范围内温度稳定性较好；最适反应pH值为6.0，在pH 4.0～6.0范围内稳定性较好。Cu2+对酶活有明显的激活作用；Co2+对酶活有明显的抑制作用。
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