葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁在微生物作用下，经历复杂的生物化学变化形成的具有独特风味的酒精饮品。近年来，随着葡萄酒文化的普及和消费市场的扩大，葡萄酒受到越来越多消费者的青睐。同时，伴随着科技的发展和人们健康意识的增强，葡萄酒的质量安全问题也越来越受到重视，特别是一些生物性来源危害物质备受关注。葡萄酒的生产主要包括微生物的发酵和储藏两个过程，这些过程条件控制不当，葡萄酒容易产生有毒有害物质。此外，加工过程操作不规范和卫生条件差等原因会造成外来微生物的污染。
葡萄酒中的生物性来源有害产物主要是由一些微生物代谢产生的对葡萄酒饮用质量和食品安全造成影响的一些物质，长期过量摄入这些物质可能会引发一系列疾病，如葡萄酒发酵过程中一些微生物可通过尿素循环途径产生氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）[1-2]、黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌污染会产生赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）[3]、氨基酸脱羧会产生生物胺（biogenic amine，BAs）[4]，这些物质长期过量累积可能会诱发癌症等疾病；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）污染产生肠毒素等多种毒素可能会引发一系列急性中毒[5]；一些真菌产生的2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trinitroanisole，TCA）会严重败坏葡萄酒的品质[6]。
为了预防和减少葡萄酒中有害物质的产生和污染，葡萄酒生产和消费量多的国家早在20世纪80年代开始就陆续制定了相应的限量标准[7]，如氨基甲酸乙酯在1943年被证实为一种致癌物质，国际癌症研究所将其归为“2B”类致癌物，先后在蒸馏酒、白兰地等多种发酵饮料和食品中被发现。1985年加拿大政府首次规定了氨基甲酸乙酯在佐餐葡萄酒中的限量（30 μg/L），随后，美国于1988年规定了佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯的非强制限量（15 μg/L），欧盟的一些成员国和韩国也做出了相应的限量规定，由表1可以清楚的看到世界上几个知名葡萄酒产国对几种生物行来源有害产物的限量标准。2007年氨基甲酸乙酯被国际癌症机构重新归为“2A”类致癌物，但到目前为止，我国仍未有相应的限量标准。并且由于我国的葡萄酒产业起步相对较晚，生产条件较差，相关的技术人员短缺，普通工作人员生产过程中食品安全控制意识不强，检测条件也相对落后，加上经营者利益至上的生产方式，使得葡萄酒的质量安全状况不容乐观。
表1 葡萄酒中生物性来源有害物质限量
Table 1 Limits of hazards of biological origin in wine
注：表中的横线表示暂无标准。
基于此，本文主要介绍了氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、金黄色葡萄球菌、生物胺和2,4,6-三氯苯甲醚5种葡萄酒中可能存在（或超标）的生物性来源有害产物，从其来源、危害、影响因素、限量、检测方法及防控措施几方面进行概述，以期为葡萄酒质量安全的检测和防控提供较为系统、全面的参考。
1 氨基甲酸乙酯
氨基甲酸乙酯（EC）别称尿烷、乌拉坦等。广泛存在于酒精饮料、酸奶和面包等发酵食品中[1]。近年来，随着人们对EC认识的深入，发现EC对人类健康存在潜在的威胁，并被世界卫生组织列为人类可能的“2A”类致癌物，具有遗传毒性和多位点致癌性，可导致动物患肺癌、肝癌和血管癌等[7]。EC的致癌性与代谢形成EC后的环氧化有关，环氧化可导致包括肺、肝和乳腺等多个器官内脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的内收和突变[13]。葡萄酒等酒精饮料是摄入EC的主要来源，且乙醇具有促进EC致癌的作用[14]。联合国粮食及农业组织和世界卫生组织专家建议，应尽量降低发酵饮料中EC的含量以保障人类健康。
1.1 EC的来源及影响因素
葡萄酒中的EC主要由酵母和乳酸菌发酵过程中的精氨酸代谢产生，参与EC形成的前体物质有尿素、瓜氨酸、氨基甲酰磷酸、氰酸和焦碳酸二乙酯[2]。EC形成的两条主要途径分别为乙醇与尿素和瓜氨酸的反应，其中尿素循环途径是最主要的[1]。
EC的含量与原料品质和工艺有关，原料品质及工艺会影响前体物质的含量，从而影响EC的含量。EC的含量会随发酵过程前体物质的消耗[1]和陈酿时间延长而增加[15]；此外，生物学条件、葡萄品种、陈酿容器等都会影响葡萄酒中EC浓度的变化[15]。
1.2 EC的检测及防控方法
目前，应用于葡萄酒中EC检测的方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和气相色谱（gas chromatography，GC）法[14]。其中，GC是目前定量EC最权威的方法，可以进行痕量水平的检测[2]。TU Q Q等[16]选用了一种新的辅助提取剂，采用多维气相色谱-质谱联用，测定葡萄酒中的EC，并对进样量、氯化钠、酸浓度等影响提取效率的因素进行了优化验证，该方法具有良好线性（R2=0.999 8）、灵敏度、精密度和准确度，且检出限（limit of detection，LOD）0.02 μg/L和定量限（limit of quantitation，LOQ）0.10 μg/L均低于之前的文献报道。除了不断改进的HPLC和GC技术，红外光谱[17]和电化学传感器[14]等用于EC分析检测的技术也在不断得到改进。旨在为葡萄酒及其他食品中EC的检测提供更加准确、高效的方法。
在葡萄酒生产过程中，控制EC含量的方法可分为物理、化学方法及酶学和代谢工程技术。酶学和代谢工程技术近年来很受欢迎，它们不改变菌株和工艺条件即可有效降低EC，并保持原有的风味，如利用尿素酶降解EC或降解尿素来减少前体物的含量来控制EC的含量[18]，利用微生物基因相关转录因子调控降低尿素和EC的代谢[19]。此外，还可以通过木炭、树脂吸附过滤葡萄原料；避免过量施用氮肥，选择产生精氨酸水平较低的优良葡萄品种；进行工艺优化，控制好发酵和储存过程中的温度、pH值和乙醇含量等[2]物理方法；通过添加氰化物、铜等催化剂等化学方法降低EC及前体的含量。
2 赭曲霉毒素A
赭曲霉毒素A（OTA）是最常见的霉菌毒素之一，是由不同的曲霉、青霉属丝状真菌产生的次生代谢产物。具有肾毒性、致癌性和肝毒性等，同时具有较高的热稳定性和化学稳定性，不易降解[3]，摄入过量会对人类和动物的健康构成严重的威胁。
2.1 OTA的来源及影响因素
OTA最初是在葡萄酒和葡萄汁中发现的，广泛存在于自然界中[20]。多项研究表明，黑曲霉科是葡萄中OTA污染的主要来源[3]。OTA的产生受水分活度、温度和葡萄品种等因素的影响（OTA的产生需要适宜的温度和湿度，不同的葡萄品种对真菌侵染也有不同的抗性），葡萄成熟期间高温、高湿和降雨都会加重OTA污染[3]。还有研究发现，随着葡萄成熟过程pH值、总糖、总可溶性固形物和总花青素的升高，OTA及其衍生物的含量也逐渐升高，所以，成熟阶段的葡萄更容易产生OTA[21]。
2.2 OTA的检测及防控方法
薄层色谱法、HPLC和GC法是OTA的常规分析检测方法，此外，还有传感器法、酶联免疫吸附法等免疫化学法[22]。免疫化学法是一种比较经济、高通量的方法，但其应用受抗体制备和稳定性等因素的限制。为了克服这些缺点，出现了很多新型传感器。YIN X T等[20]以金纳米粒子为探针，36聚体适配体为识别元件，利用OTA和金纳米粒子特异性识别来实现OTA的定量，线性范围为32～1 024 ng/mL，检出限为20 ng/L，该比色生物分析法相比其他抗体法具有更好的选择性。WU K F等[23]研发了一种适配体荧光生物传感器，由核糖核酸酶H辅助的循环反应组成，将信号显著放大，检测限可达0.08 ng/mL，回收率在96.1%～107.5%之间，具有高选择性，可以通过替换识别适配体序列扩展到其他毒素检测。
葡萄酒中OTA的污染，一般在葡萄生长期间产生，也可能源于后期污染，减少葡萄酒中OTA可以分前期预防和后期去除两部分。自然条件是不可控的，前期预防主要通过保护葡萄免受机械和虫害损伤、剔除受损葡萄；减少与杂草和不卫生的材料等接触；利用拮抗微生物与具有抑菌性的天然抗氧化剂（如香草醛）或低剂量杀菌剂联用进行生物防治来控制植物病原菌等[24]。后期去除主要通过向葡萄汁或葡萄酒中加入明胶、膨润土和活性炭等澄清剂澄清，这是生产过程中从葡萄酒中除去OTA的重要途径。还可以通过对水分活度、温度、pH和卫生等的控制来减少生产、贮存和销售过程中OTA的产生和污染。利用酵母吸附OTA是一种有前途的生物方法，CARRASCO-SANCHEZ V等[25]研究发现，实验中所有添加酵母的葡萄酒中OTA含量都降低，红葡萄酒中的去除效果较好，其原因可能由于花色苷和OTA之间的化学键对酵母吸附OTA具有增强作用。
3 生物胺
生物胺（BAs）是一类具有生物活性的含氮低分子质量有机化合物的总称，按结构可以分为脂肪族胺、芳香胺和杂环胺。
3.1 BAs的来源及影响因素
生物胺源于原料本身或生产、陈酿和贮藏过程[9]。发酵食品中的BAs主要是乳酸菌等微生物作用下由氨基酸脱羧或醛类物质在氨基酸转氨酶的转氨作用下形成的一种不良代谢产物[4]。摄入过量的BAs会引起头痛、腹泻、过敏等不良反应，严重时可危及生命[26]。人体中含有可以降解BAs的酶，但这些酶的活性会受到乙醇和乙醛的抑制，使脱毒效率减小[4]。葡萄酒中相关的BAs主要有组胺、腐胺和酪胺，组胺含量是葡萄酒生产卫生质量的指标之一[27]。李志军等[28]分析250款国产葡萄酒中8种生物胺，其中组胺的含量为0～14 mg/L，检出率为52%，其中含量高于10 mg/L（德国组胺限量）的占比1.2%，高于2 mg/L（瑞士、奥地利等国组胺限量）的占比23.2%。
前体氨基酸和具有脱羧酶活性的微生物的存在及它们的浓度是影响BAs含量的主要因素[29]。组胺的含量会随着补充氨基酸含量的增加而增加[30]，菌种类型及接种量都对BAs的含量有影响，菌种类型对BAs含量的影响更显著，且发酵完成后，BAs含量随贮存温度的升高而升高[31]。此外，酒龄、容器类型和乙醇浓度[30]等对BAs的产生都有影响，陈酿时间较短的葡萄酒和陈酿在橡木桶中的葡萄酒BAs含量相对较高[32]。总体来说，菌种类型及含量直接影响酶活性及与前体物质反应的效率，其他因素则可能会通过影响酶活性或前体物质含量间接影响BAs的生成。
3.2 生物胺的检测及防控方法
生物胺的检测方法有色谱法、毛细管电泳法[33]和生物传感器法[34]等。液相色谱在BAs检测中应用最广泛，但成本高。薄层色谱法则具有简便、廉价的优势，ROMANO A等[35]改进了一种适用于常规葡萄酒分析，能实现组胺、酪胺等几种生物胺的高通量检测的新型薄层色谱法。
生物胺的防控可以根据需要控制生产过程及贮存条件来减少BAs的形成[30]，严格控制卫生条件，避免外来微生物的污染，选用少量产生或不产BAs的菌株，选择适当的发酵、贮存温度等。CARMEN B等[26]首次发现，一株本地酒酒球菌用于苹果酸-乳酸发酵，可显著降低组胺的生成，与未接种的对照相比减少了5倍，接种一年后，比未接种的低3倍。此外，还可以通过定量聚合酶链式反应（quantitative polymerasechain reaction，qPCR）测定生物胺产生菌含量，预测葡萄酒中生物胺的积累风险，从而进行控制[29]。
4 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一类能产生溶血素、肠毒素和杀白细胞素等多种毒素和酶的致病菌。是一种常见的感染源，也是一种常见的人类共生菌[36]，能引起食物中毒和许多感染性疾病，对公众健康构成了严重的威胁[5]。
4.1 金黄色葡萄球菌的来源及危害
金黄色葡萄球菌广泛存在于空气、水、灰尘、人类和动物排泄物中[37]，原料、生产者、加工设备等都是S.aureus污染的可能来源。其生长受温度、水分活度、pH值等因素的影响，这些因素会通过影响它的生理活性而影响毒素和酶的产生。李金春等[38]研究发现：在一定的范围内，金黄色葡萄球菌生长速率随着温度、pH值和水分活度的增加而增加。据美国疾病控制中心数据显示，由S.aureus引起的食物中毒排名第二[5]，S.aureus还有会导致心内膜炎、脓肿和休克综合症等[37]。
4.2 金黄色葡萄球菌检测及防控方法
平板法[39]作为S.aureus检测的传统方法，具有灵敏、廉价的特点，被视为黄金标准，但操作复杂、耗时，所以目前生物传感器、免疫学、分子生物学等快速检测方法逐渐得到发展[5]，但较高的成本和复杂的程序一定程度上限制了这些方法的使用[40]。SHAN Y Q等[40]研制了一种用于S.aureus特异性检测的新型传感器，将S.aureus单克隆抗体固定在作为捕获探针的荧光微球上，荧光素标记的S.aureus抗体是指示信号，用荧光微球和荧光素双重标记后，用多参数流式细胞仪对S.aureus进行富集观察，该方法假阳性显著减少，对S.aureus有较好的特异性。LIU C Y 等[37]采用变性气泡介导的链交换扩增（strand exchange amplification，SEA）核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）一步法进行研究，设计了一对S.aureus的特异性引物，进行SEA反应，肉眼即可观察到扩增反应的结果，从浅黄色到红色颜色变化明显，从而实现了S.aureus的检测；该法与电镀法有很大的一致性，且较简单省时，无需昂贵设备。此外，还有多重PCR检测、酶联免疫吸附法、石化膜法[41]等方法。
葡萄酒中S.aureus的防控可以从外部防控和内部调控两方面进行。通过选用优质卫生的原料，保证从业人员的健康及加工用具的卫生等来防止S.aureus的外来污染是预防污染最有效的方式；还可通过对温度、水分活度和pH的适当调控来抑制S.aureus的生长和毒素的产生。近年来，还有许多关于芦丁[42]、精油[43]、柠檬酸[44]等天然提取成分用来抑制S.aureus生长的研究，具有很好的应用潜力。
5 2,4,6-三氯苯甲醚
2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）是一种由青霉、曲霉、放线菌和链霉菌等真菌引起的甲基化产物[6]。TCA主要是通过影响葡萄酒的感官品质，给葡萄酒行业造成巨大的经济损失，对人体健康的影响目前尚未见报道。
5.1 TCA的来源及危害
葡萄酒中的TCA污染主要是由真菌降解木塞中的氯酚形成的[45]，是葡萄酒中“木塞味”的主要来源。此外，TCA污染还可能来自杀菌剂、漂白剂和橡木桶等，其中可能含有氯酚等能通过氯化和甲基化反应形成TCA的成分[46]。木塞味会一定程度上掩盖葡萄酒本身的香气[47]，对葡萄酒的质量造成影响。每年受TCA污染的已装瓶葡萄酒约占5%～7%，损失达100亿美元[48]。报告显示，软木塞迁移到葡萄酒中的TCA质量浓度为2.4～210.0 ng/L[49]，而消费者对TCA的感知阈值和排斥阈值分别为2.1×10-12 g/L和3.1×10-12g/L[50]。TCA污染给世界葡萄酒生产和消费带来严重的负面影响。
5.2 TCA的检测及防控方法
TCA的常规检测方法有色谱法、传感器法和感官方法[46]。色谱法是最常用的方法，其中，气相色谱法是目前应用最广泛的方法[46]。GC系列方法有很多，如浊点萃取-气相色谱质谱法[51]和顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱法[52]等。近年来，生物传感器以其小型、廉价、可持续的自动化系统的优势，有潜力替代传统分析方法（HPLC、GC），相关的研究主要集中在利用抗体、细胞或它们的组合作为生物识别元件或以无创光学检测为原理的生物分析法上[53]。APOSTOLOU T等[54]改进了一种基于特异性抗体的便携生物传感器，分析速度快，能够在5 min内检测到极低质量浓度的TCA（低至0.2 ng/kg），便携，能直接用于现场检测，实现高通量筛选软木塞，且不需要任何辅助基础设施。此外，还有红外光谱[45]和荧光探针等[55]方法。
防止TCA污染，严格控制生产过程，保证原料、设备和环境等清洁卫生，避免真菌污染是关键；尽量减少含氯的杀虫剂、漂白剂和防腐剂的使用；寻找软木塞的替代品，如玻璃塞、螺旋塞等；采用特殊工艺方法去除，GUEDES P等[56]研究了从软木塞中去除TCA的电化学工艺，发现低水平直流电的应用对TCA的减少有积极的作用，经电化学处理后78%的软木塞的TCA水平低于检测限值，此外软木塞在盐水溶液中浸泡24 h后，TCA去除率可提高10%～15%。
6 小结
本文介绍了氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素、生物胺、金黄色葡萄球菌和2,4,6-三氯苯甲醚五种影响葡萄酒质量和安全的生物性来源有害物质，着重从它们的来源、危害、影响因素、检测方法及防控措施五个方面进行了阐释。首先，从它们的来源、危害及影响因素方面进行了总结，如图1所示。氨基甲酸乙酯是由尿素、瓜氨酸等几种前体物质反应形成的，同时前体物质含量及反应过程又受原料、工艺、微生物和环境条件等多种因素的影响，过量摄入具有致癌性；赭曲霉毒素A是由曲霉等多种真菌产生，受到多种内在生长因素和外在环境因素的影响，过量摄入也具有致癌性；生物胺是由氨基酸或醛类产生的一组不良代谢产物，受微生物、葡萄品种和酒龄等因素的影响，能引起多种急性或慢性疾病；2,4,6-三氯苯甲醚主要来源于受霉菌等真菌污染的木塞，也可能来源于其他含氯的化合物，会给葡萄酒带来不良的“木塞味”，造成葡萄酒感官品质下降；金黄色葡萄球菌污染一般是由原料或生产过程污染造成的，能分泌溶血素等多种毒素，造成溶血、组织坏死等多种病症。
最后，对这5种生物性来源危害有害产物的检测方法进行了归纳整理，如表2所示，以期为这些有害物质的检测及防控提供一定的参考，这5种有害产物都可以采用HPLC和传感器进行检测；氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺和2,4,6-三氯苯甲醚都能通过GC和光谱法进行检测。
图1 葡萄酒中生物性来源危害物质的危害流程
Fig.1 Hazard flow of biological hazards substance in wine
注：“▲”表示主要形成途径或影响因素。
表2 葡萄酒中生物性危害物质来源及检测方法
Table 2 Sources and detection methods of biological hazards substance in wine
7 展望
随着大众食品安全意识的提高，葡萄酒的质量安全问题也逐渐受到消费者的广泛关注。相关的检测技术和安全标准也在不断完善与更新，但对于很多物质还是缺少经济、简便、准确、及时高效的适用于现场检测的方法，不利于葡萄酒中有害物质的检测；同时国内缺乏相应的标准体系，加上生产者安全知识匮乏及利益至上的生产方式，使得葡萄酒的质量安全状况不容乐观，造成各生产企业产品良莠不齐。本文阐释和归纳了近年来研究较多的几种葡萄酒生物性来源危害，这些危害主要来源于葡萄原料和酿造过程，因此对葡萄酒中有害代谢产物的防控要从源头入手，实现生产优质原料，优化酿造工艺，并加快完善葡萄酒相关检测技术，为生产高质量、安全的葡萄酒提供更为系统、全面的保障，推动我国葡萄酒产业健康发展。
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