酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是对人类有益的一类微生物，常被用来制作面包、啤酒和葡萄酒等发酵食品，除此之外，其也广泛应用在溶剂、乳化剂和燃料等工业领域[1]。酿酒酵母因具有发酵速度快和产酒精浓度高等优点而成为学者研究的重点。但在发酵过程中，酿酒酵母细胞受到乙醇、酸度、渗透压和营养成分不足等因素的影响[2]，生长代谢受到抑制，其中乙醇胁迫是影响较大的因素之一[3]。
酿酒酵母细胞中含有许多抵御乙醇胁迫的成分，如菌体海藻糖[4]、与细胞膜流动性有密切联系的脂肪酸[5]、与菌体蛋白相关的氨基酸等[6]。其中海藻糖是酿酒酵母在乙醇胁迫下产生的重要应激产物，能够特异性保护菌体蛋白质、生物膜和核酸等大分子结构[7]。海藻糖发挥的作用是双重的：一是海藻糖取代水并与磷脂极性基团结合来保持膜结构的完整性；二是海藻糖还可以起到伴侣蛋白作用，抑制变性蛋白质聚集，为蛋白质复性提供能量[8]。海藻糖除了提高酿酒酵母的乙醇胁迫外，在其他不利环境（如高温、冷冻、剪切力和有毒物质）中也起着至关重要的作用[9]。本文对乙醇胁迫下酿酒酵母细胞的耐受机制及海藻糖与酿酒酵母乙醇胁迫的关系进行综述，旨在为提高酿酒酵母的乙醇耐受性提供参考。
乙醇是酿酒酵母发酵生成的主要副产物，高浓度乙醇对酵母细胞会产生抑制作用，酵母菌则产生一系列的应激反应来保证正常的生长代谢，这种应对机制即为酿酒酵母乙醇耐受性[10]。乙醇对酵母细胞的影响主要体现为降低酵母细胞存活率和细胞生长速率，进而导致发酵过程的终止[11]。因此，研究耐酒精酿酒酵母的筛选和发酵特性的评价具有重要意义。
1.1.1 酵母细胞壁与乙醇耐受性的关系
细胞壁的完整性在酿酒酵母乙醇耐受性发挥着重要作用。酿酒酵母细胞壁的主要成分是D-葡萄糖、D-甘露糖、蛋白质、几丁质和极少量的脂类物质和矿物质。在高浓度酒精的环境下，细胞壁中的成分会发生改变以抵御酒精等不利环境，减轻对细胞结构的破坏[12]。葡萄糖和甘露糖构成的细胞壁具有一定的韧性，细胞壁蛋白固定在细胞壁上，可以起到防止酒精溶解酵母细胞的作用[13]。细胞壁麦角固醇和多种脂肪酸可以调节细胞膜的渗透性，提高酿酒酵母的存活率[14]。
除酿酒酵母细胞壁结构外，细胞壁合成基因与乙醇耐受性也存在一定的关联。这些基因包括葡聚糖合成基因、β-1,3葡聚糖合成基因FKS1和β-1,6葡聚糖合成基因KRE6[15]，细胞壁蛋白基因SPl1和其他细胞壁基因BEM2、PAT1、ROM2、VPS34、ADA2[16]。
1.1.2 细胞内膜系统与乙醇耐受性的关系
乙醇对酿酒酵母内膜系统产生毒害作用的部位有细胞膜、亲水蛋白、疏水蛋白和内质网[17]，其主要目标是膜结构。高浓度乙醇会导致膜流动性和通透性增加，从而破坏膜完整性，酵母细胞可以通过改变膜结构来防止膜流化和稳定质膜[18]，达到抵御乙醇压力的目的[19]。
不饱和脂肪酸和麦角固醇是细胞膜的重要成分，ALEXANDRE H等[20]研究发现，当乙醇浓度升高时，麦角固醇含量也会增加。ARCHANA K M等[21]研究发现，在培养基中加入不饱和脂肪酸，酿酒酵母抵御乙醇毒害的能力会提高。除此之外，乙醇还通过减少生物分子的水化外壳的方式使其受到活性氧的攻击，在此过程中乙醇取代水并改变分子在细胞膜上的位置，最终破坏膜的结构和功能[22]。
酿酒酵母在高浓度乙醇中会做出一系列应激反应，与酿酒酵母乙醇耐受性密切相关的基因主要有：热激蛋白合成基因、与乙醇耐受性相关的内源基因、某些氨基酸的合成基因以及海藻糖合成酶基因[23]。
1.2.1 热激蛋白合成基因
热激蛋白是酿酒酵母在胁迫条件下产生的特殊蛋白，热激蛋白合成基因主要有Hsp12、Hsp30、Hsp70、Hsp78、Hsp82、Hsp104等。CHANDLER M等[24]采用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）微阵列分析的方法研究酿酒酵母在体积分数5%酒精培养基中好氧培养物的基因，通过与原始菌株对比，经过酒精处理的酵母菌Hsp104、Hsp26、Hsp30、Hsp70和Hsp12的基因在转录水平上提高幅度较大，热激蛋白合成量较多。基因Hsp70具有稳定细胞膜结构、参与其他蛋白质的合成与折叠和抑制蛋白质分解的作用[25]。MARKS V D等[26]研究发现，酿酒酵母在乙醇胁迫下热激蛋白Hsp70家族基因SSE1、SSA1和SSA2表达上调。Hsp12是与细胞膜相关的蛋白质，在高浓度酒精中维持质膜完整性，Hsp104则充当变性蛋白质分解中的重塑剂[27]。
1.2.2 酵母内源性基因
酵母内源性基因过表达可以提高酿酒酵母乙醇耐受性，逆代谢工程方法可以识别酿酒酵母潜在的与乙醇耐受性相关的基因靶点。HONG M E等[28]选择酵母内源性基因作为研究对象，采用逆代谢工程方法识别过表达基因靶点，其中基因靶点INO1、DOG1、HAL1和截短的MSN2基因与乙醇耐受性有着密切联系，将这四种质粒重组酵母进行乙醇耐受性实验，结果发现，这四种质粒过表达都能增强酵母乙醇耐受性，其中基因INO1过表达的效果最好。
1.2.3 氨基酸基因
酵母细胞中某些氨基酸在提高酿酒酵母乙醇耐受性发挥重要作用，如脯氨酸、精氨酸和色氨酸。脯氨酸主要通过促进GK蛋白的生成来提升酿酒酵母的乙醇耐受性[29]，精氨酸可以抑制酵母体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，从而对乙醇诱导的细胞壁、细胞膜和细胞内细胞器起到保护作用[30]，HIRASAWA T等[31]研究发现，色氨酸合成基因（即TRP1，TRP2，TRP3，TRP4和TRP5）缺失则会导致酵母对乙醇胁迫更加敏感。
1.2.4 海藻糖合成酶基因
酿酒酵母乙醇耐受性与菌体海藻糖含量有着密切的联系，高浓度乙醇诱导海藻糖合成酶基因和降解酶基因的表达，促使酵母生成大量的海藻糖来抵御乙醇胁迫[24]。与海藻糖合成代谢密切相关的基因主要有海藻糖合成基因和海藻糖酶基因。海藻糖合成基因主要有TPS1、TPS2和TLS1；海藻糖酶基因主要有中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1[8，32]。不同倍体酿酒酵母在高浓度酒精中的基因表达存在差异，ZHANG K等[33]通过转录组分析得出单倍体和三倍体酿酒酵母基因TPS1、TPS2和TLS1上调程度比基因NTH1、NTH2和ATH1上调程度高，从而使酿酒酵母积累更多海藻糖。酿酒酵母在不同时期的基因表达略有差异，YI C F等[34]研究发现，生长指数期的酿酒酵母基因NTH1和NTH2表达下调，海藻糖分解量减少，海藻糖累积量增加。生长稳定期的酿酒酵母基因NTH1、NTH2、TPS1和ATH1表达上调，TPS2表达下调，从而使酿酒酵母菌体海藻糖达到稳定趋势。
乙醇诱导海藻糖合成基因表达生成大量海藻糖，但过量海藻糖抑制热激蛋白发挥稳定蛋白质的作用，海藻糖酶基因表达使海藻糖降解，有利于发挥其他应激物质的保护作用[20]。因此，海藻糖合成基因和海藻糖酶基因共同赋予酿酒酵母抵御乙醇胁迫的能力。
海藻糖是由葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合构成，是一种非还原性二糖[9]，海藻糖稳定性强，只有海藻糖酶才会将其分解成葡萄糖[35]。海藻糖具有高度水合能力和强稳定性等优势，在胁迫环境中起到维持生物大分子结构和功能的作用[11]，是评价酵母乙醇耐受性的重要指标[36]。
海藻糖是酵母在胁迫条件下的保护剂，酵母存活率随着菌体海藻糖累积量增加而增加[37-38]。当酵母处在致死浓度的乙醇中，海藻糖起到稳定酵母细胞膜、保护细胞质蛋白和修复变性蛋白的作用[8，39]，还可以帮助菌体蛋白进行适当折叠和修复，防止蛋白质聚集和羰基化[22，40-41]，通过取代酵母细胞膜上的水和乙醇，与脂质极性基团之间形成氢键，稳定膜结构[43]。除此之外，海藻糖在流体条件下可以维持脂质双分子层结构，海藻糖还是抵御细胞内部和外部乙醇毒性的重要物质之一，能够防止乙醇诱导的酵母细胞和羧基荧光素捕获的脂质体模型系统中的电解质流失[22]。
一些学者采用进化差异理论的诱变技术分离酵母突变菌株并进行乙醇冲击实验，结果发现，海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表达水平呈现上调的趋势，这表明乙醇诱导海藻糖合成基因的表达以产生更多海藻糖抵御乙醇胁迫[44-45]。MAHMUD S A等[8]将中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1同时敲除，将海藻糖酶缺陷菌株进行乙醇耐受性实验，结果表明，缺陷菌株海藻糖合成基因TPS1和TPS2表达增强，缺陷菌株海藻糖含量比原始菌株FY834高，通过实验得出过表达基因TPS2产生的海藻糖含量高于过表达基因TPS1产生的海藻糖含量。
酿酒酵母在高浓度乙醇中，除了海藻糖合成基因表达增强外，中性海藻糖酶基因和酸性海藻糖酶基因表达也会增强。TAO X L等[45]以酿酒酵母敏感菌株Z5和耐酒精菌株SZ3-1为实验对象，用体积分数10%的酒精进行冲击实验，发现海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表达水平呈现上调的趋势；除此之外，酸性海藻糖酶基因ATH1和中性海藻糖酶基因NTH1的表达水平也呈现上调趋势。
高浓度乙醇会损害酿酒酵母体内代谢过程，使酵母无法产生大量海藻糖来抵御乙醇胁迫[40]。酵母菌获取能量和营养物质的主要途径是培养基，一些学者研究发现，在培养基中加入海藻糖，可以有效提高酿酒酵母的乙醇耐受性[3，46]。刘琦等[47]将葡萄酒泥酵母中的海藻糖提取物以300 mg/L的添加量加入到模拟葡萄汁中，研究其对酵母乙醇耐受性的影响。结果表明，酵母在稳定期的生物量和存活率都大幅提高，说明海藻糖可以提高酵母的乙醇耐受性。由此得出，外源添加海藻糖提高酿酒酵母乙醇耐受性，可以有效改善酿酒酵母发酵特性，有利于酒精工业的发展。
尽管DNA芯片、基因工程、基因组学和转录组学技术的发展，使得酵母的乙醇胁迫机制的研究已经深入到分子遗传学层次，但海藻糖对酿酒酵母的保护机理还未有统一定论。目前，国内外学者的研究重点主要集中在内源海藻糖提高酿酒酵母乙醇耐受性的机理，但对于外源海藻糖与酿酒酵母之间的结合位点和相互作用力以及其他作用机理研究较少。因此，研究外源海藻糖提高酿酒酵母乙醇耐受性对于发酵工业具有重要意义。
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