香蕉隶属芭蕉科（Musaceae），富含碳水化合物、矿物质和多种维生素，同时含有酚类、类黄酮等活性成分物质，具有润肠通便、抗氧化等保健功效[1-2]。香蕉除鲜食外，还可作为原料生产加工成其他复合果汁饮料产品[3]。芒果隶属漆树科（Anacardiaceae）芒果属（Meagifera），素有“热带果王”之称[4]，其果肉细腻多汁，风味独特，富含糖，维生素A、B、C，胡萝卜素以及人体必需的微量元素硒、钙、磷、钾等[5-6]。六堡茶属黑茶，因产于广西梧州六堡镇而得名，据悉于清朝时，就以减肥、助消化、降脂等功效而闻名[7]。临床研究表明，六堡茶具有降血脂、抗凝血、抗氧化[8-9]、调节肠道菌群等功效，具有很高的开发利用价值[10]。
发酵型饮料以果蔬为原料通过微生物发酵酿制而成，其酒精含量在1%vol以下[11]，与普通饮料相比，不仅清凉、止渴，还较好地保存了其营养素，达到调节人体生理功能的目的[12]。经益生菌发酵所得饮料，是现代发酵技术在水果和乳制品混合原料深加工领域的具体应用，对提升适口性、储藏性和营养性具有重要意义，符合当前饮料的发展消费趋势，市场前景广阔[13]。
该课题结合近年来流行的佰生优益生菌产品，研究了以香蕉、芒果、六堡茶为原料，添加多种益生菌发酵，优化了发酵工艺条件，开发出一款发酵风味浓郁、口感酸甜爽口、营养价值丰富的发酵型香蕉复合果汁饮料，并跟踪测定该饮料在发酵期间理化指标和活性成分的含量，掌握其主要理化指标和活性成分的变化规律，对香蕉复合果汁饮料的品质进行评价，以期为发酵型香蕉果汁饮料工业化生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香蕉、芒果：南宁市广百家超市；六堡茶（三级成品茶）：中国茶叶有限公司；果胶酶（1万U/g）：南宁东恒华道生物科技有限公司；佰生优益生菌果蔬酵素发酵菌：昆山佰生优生物科技有限公司；牛血清蛋白溶液（生物技术级）：Luminex公司；考马斯亮蓝G250（分析纯）、没食子酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SM-X电热恒温鼓风干燥箱：上海徐吉电气有限公司；LRH-150生化培养箱：上海一恒科技有限公司；TM-767Ⅲ打浆机：中山市海盘电器有限公司；HWS-26水浴锅：上海齐欣科学有限公司；VIS-7220N分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；TDL-40B飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵型香蕉复合果汁饮料制备工艺流程
1.3.2 香蕉复合果汁饮料制备工艺操作要点
（1）香蕉浆及芒果汁的制备
原料选择：选择无褐变、无腐烂、表面无刮伤且结实的果实。
预处理：香蕉、芒果去皮切块后称质量并记录。
打浆：将预处理的果肉放入打浆机中打浆。
酶解：将香蕉、芒果浆分别置于烧杯中，加入0.3%果胶酶和0.3%糖化酶，用保鲜膜封口，置于恒温为50 ℃的水浴锅中酶解3 h。
过滤：将酶解的香蕉、芒果浆分别用过滤网过滤。
杀菌冷却：过滤好的香蕉、芒果汁于85 ℃杀菌15 min，冷却后于4 ℃条件下密封贮藏，备用。
（2）六堡茶汤的制备
醒茶：沸水醒茶。醒茶时，将热水注入后尽快将水倒去，重复操作两次，时间控制在3 s之内。
泡茶：开水冲泡。将纯水煮沸后，立即以1∶50的茶水质量比进行闷泡10 min，重复操作两次。
过滤：闷泡结束后用四层纱布（100目）滤尽茶汤，合并两次冲泡的茶汤。
杀菌冷却：茶汤于85 ℃杀菌15 min，冷却后于4 ℃条件下密封贮藏，备用。
1.3.3 香蕉复合果汁饮料制备工艺优化单因素试验
以香蕉浆50%，芒果汁5.0%，白砂糖添加量6 g/100 mL为基础配比，考察不同茶汤添加量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）、发酵温度（30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃）、发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、酵素接种量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）对香蕉复合果汁饮料感官评分的影响。
1.3.4 香蕉复合果汁饮料制备工艺优化响应面试验
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，采用3因素3水平的响应面分析方法对发酵型香蕉复合果汁饮料的发酵工艺进行优化。因素与水平见表1。
表1 香蕉复合果汁饮料发酵条件优化响应面分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for banana compound juice beverage fermentation optimization
1.3.5 感官评价
在已优化的发酵工艺条件下对香蕉复合果汁饮料进行感官评分，通过感官评分值，验证响应面法的可行性。选取10名经过感官培训的人员，对发酵型香蕉复合果汁饮料的状态、色泽、气味与口感进行感官分析，并根据果汁的感官评价标准（表2）进行评分（满分100分）。
表2 发酵型香蕉复合果汁饮料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of fermented banana compound juice beverage
1.3.6 理化指标测定
可溶性固形物测定：使用手持式阿贝折光仪测定；可滴定酸度测定：参照张莉丽等[14]可滴定酸度测定方法；蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定[15]；总糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定[16]；总酚含量的测定：采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法测定[17]。
1.3.7 数据处理
实验所得数据采用Origin 9.1和Design Expert 10软件进行绘图、数据处理及分析，采用Adobe Illustrator CS5软件进行数据图表的修饰。
2 结果与分析
2.1 香蕉复合果汁饮料制备工艺优化单因素试验
2.1.1 茶汤添加量对香蕉复合果汁饮料品质的影响
茶汤添加量对饮料品质的影响见图1。由图1可知，随着茶汤添加量的增加，复合果汁饮料的感官评分先增加后降低，当六堡茶汤添加量为5.0%时，饮料的口感达到最佳状态，既有香蕉汁及芒果汁的滋味和香气又含有六堡茶的茶香，风味、色泽协调，当六堡茶汤添加量＞5.0%之后，茶味逐渐掩盖住果汁的香气和风味，且饮料颜色发暗。故最佳茶汤添加量为5.0%。
图1 茶汤添加量对香蕉复合果汁饮料品质的影响
Fig.1 Effects of tea soup addition on the quality of banana compound juice beverage
2.1.2 发酵温度对香蕉复合果汁饮料品质的影响
图2 发酵温度对香蕉复合果汁饮料品质的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of banana compound juice beverage
发酵温度对饮料品质的影响见图2。由图2可知，随着温度升高，复合果汁饮料的感官评分先升高后降低。发酵温度为32 ℃时，复合果汁饮料的感官评分最高，此时饮料颜色淡黄透亮，具有较突出的香蕉汁及芒果汁的复合滋味和香气。温度较低时，菌体内酶活性受到抑制，使得发酵产酸速率较慢，同时菌体的繁殖速率也会降低；温度较高时，菌体的生长受到抑制，菌体有可能遭到破坏，产生影响饮料品质的物质。因此，复合果汁饮料在32 ℃条件下进行发酵口感最佳。
2.1.3 发酵时间对香蕉复合果汁饮料品质的影响
发酵时间对饮料品质的影响见图3。由图3可知，发酵时间对饮料感官评分的影响较大，随着发酵时间的延长，饮料颜色由深变浅，口感也慢慢变酸，继而影响饮料糖酸比，掩盖了香蕉汁及芒果汁独有的香气及滋味，当发酵时间为5 d时饮料感官评分最高，且色泽淡黄透亮，香蕉及芒果的滋味和香气浓郁，糖酸比适宜。复合果汁饮料发酵前期，菌体繁殖速度较快，发酵液中风味物质含量及酸度逐渐增加，随着发酵时间的延长，产酸量会逐渐增大，使得饮料偏酸，从而影响饮料口感。因此，复合果汁饮料的最佳发酵时间为5 d。
图3 发酵时间对香蕉复合果汁饮料品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on the quality of banana compound juice beverage
2.1.4 酵素接种量对香蕉复合果汁饮料品质的影响
图4 酵素接种量对香蕉复合果汁饮料品质的影响
Fig.4 Effect of Jiaosu starter inoculum on the quality of banana compound juice beverage
酵素接种量对饮料品质的影响见图4。由图4可知，酵素接种量对饮料感官评分的影响较小，无显著变化趋势，随着发酵菌接种量增加，感官评分呈现先下降后上升并趋于平稳，且复合果汁饮料色泽、气味、口感并无明显变化，考虑成本问题，佰生优益生菌果蔬酵素最佳接种量为0.04%。
2.2 响应面试验设计及方差分析
表3 香蕉复合果汁饮料发酵条件优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface methodology for banana compound juice beverage fermentation conditions optimization
结果显示，各因素最佳条件为：茶汤添加量5.0%、发酵时间5 d、发酵温度32 ℃。采用Box-Behnken响应面设计法对发酵型香蕉复合果汁饮料工艺条件进行优化。试验结果如表3所示，利用Design Expert软件对表3数据进行二次多项回归拟合，建立以茶汤添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）为自变量的多元回归方程：
通过Design-Expert 10软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著性，对得出的方程进行方差分析，结果如表4所示。由表4可知，模型P＜0.01，说明本试验选用的二次多项模型具有高度的显著性。失拟项P＞0.05（P=0.788 0）不显著，表明感官评价的实测值与预测值有很好的拟合度，可以用该模型方程来分析和预测不同发酵工艺条件下香蕉复合果汁饮料的感官评分。
表4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface methodology
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.3 响应面分析及最优发酵工艺条件的确定
对表3回归模型系数显著性检验结果中存在显著交互作用的交互项作响应曲面图直观分析，可以进一步研究各因素间交互作用的强弱，结果见图5。由图5可知，随着各因素水平的增加，感官评分均呈现先增加后下降的趋势，并且响应面形状陡峭，说明两者的交互效应显著，这与方差分析结果相一致。
进一步用Design Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得最优的发酵工艺参数。经分析可知最优参数为：茶汤添加量4.9%，发酵时间5.1 d，发酵温度33.6 ℃。
图5 各因素交互作用对感官评分影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each two factors on sensory score
2.4 验证试验
为了检验实验结果是否与真实情况相一致，根据上述结果进行近似验证试验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件定为：茶汤添加量5.0%，发酵时间5.0 d，发酵温度34 ℃。在此条件下进行多次平行试验，得出的实际感官评分（90分）与理论预测值（89.9分）相近，此时香蕉复合果汁饮料色泽淡黄透亮、具有香蕉和芒果固有的浓郁香味，酸甜适中、香气清新，因此选取此条件为香蕉复合果汁饮料的最佳工艺参数。
2.5 营养活性成分分析
2.5.1 可溶性固形物随发酵时间的变化
图6 发酵型香蕉复合果汁饮料可溶性固形物含量随发酵时间的变化
Fig.6 Changes of soluble solids content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time
由图6可知，可溶性固形物可大致表示饮料的含糖量，发酵第1天可溶性固形物含量下降细微，发酵第3天含量上升，这可能是微生物对香蕉芒果浆进行分解导致其中的可溶性多糖溶于发酵液中，从而使发酵液中糖含量上升，可溶性固形物含量也因此上升，发酵第4天含量下降，原因可能是佰生优益生菌大量繁殖将饮料中的糖消耗所致，可溶性固形物含量总体呈上升趋势。
2.5.2 可滴定酸度随发酵时间的变化
图7 发酵型香蕉复合果汁饮料可滴定酸度随发酵时间的变化
Fig.7 Changes of titratable acidity in fermented banana compound juice beverage with fermentation time
由图7可知，随着发酵时间的延长，复合果汁饮料可滴定酸度含量呈上升趋势，这可能是香蕉复合果汁饮料中添加的佰生优益生菌果蔬酵素代谢活动产生酸性物质所致。佰生优益生菌包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌，主要发酵产物为酸性物质，在复合果汁饮料中添加的佰生优益生菌果蔬酵素发酵菌，加快了果汁饮料的发酵速度，因此随着发酵时间延长，饮料的酸性物质逐渐增加，若其酸度过高，即影响饮料口感，需合理控制发酵时间。
2.5.3 蛋白质含量随发酵时间的变化
图8 发酵型香蕉复合果汁饮料蛋白质含量随发酵时间的变化
Fig.8 Changes of protein content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time
由图8可知，发酵前2 d蛋白质含量呈明显上升趋势，可能是复合果汁饮料在益生菌作用下分解，使蛋白质融溶入发酵液中，这与文献[18]报道中蛋白质变化趋势一致。而发酵后3 d其含量处于相对平稳的状态，轻微下降可能是少量蛋白质与单宁类物质结合形成沉淀所致。
2.5.4 总糖含量随发酵时间的变化
图9 发酵型香蕉复合果汁饮料总糖含量随发酵时间的变化
Fig.9 Changes of total sugar content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time
由图9可知，发酵过程中香蕉复合果汁饮料总糖含量并没有太大变化，发酵第1天由10.67 g/100 g降至10.07 g/100 g，这可能是由于佰生优益生菌大量繁殖将饮料中的糖代谢成酸性物质，含量随后上升，原因可能是微生物对香蕉芒果浆进行分解导致其中的可溶性多糖溶于发酵液中，从而使发酵液中的总糖含量上升[13，19]。
2.5.5 总多酚含量随发酵时间的变化
图10 发酵型香蕉复合果汁总多酚含量随发酵时间的变化
Fig.10 Changes of total polyphenols content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time
由图10可知，多酚含量与饮料的保健作用和品质密切相关，多酚含量呈现先上升后下降且趋于稳定的趋势，发酵第1天总多酚含量上升至0.50 mg/mL，其原因可能是佰生优益生菌发酵过程中能使结合多酚得以释放，从而提高饮料中游离态多酚化合物含量[20]。随后其含量在0.30 mg/mL上下波动且波动幅度较小，可能是多酚类物质氧化聚合或与蛋白质和其它细胞残余物结合形成沉淀所致[21]。复合果汁饮料经发酵后，对总多酚的含量影响并不显著，保留了香蕉复合果汁饮料原有的独特风味。
2.6 发酵型香蕉复合果汁饮料总体评价
在最佳发酵工艺条件下，酿制的香蕉复合果汁饮料，其可溶性固形物含量为16.80%，可滴定酸度含量为1.20 g/kg，蛋白质含量为10.90 mg/100 g，总糖含量为9.91 g/100 g，总多酚含量为0.38 mg/mL，且饮料色泽淡黄透亮、具有香蕉和芒果固有的浓郁香味，酸甜适中、香气清新。
3 结论
本实验以香蕉、芒果、六堡茶汤为主要原料，佰生优益生菌果蔬酵素发酵菌为发酵菌种，通过发酵工艺优化以及营养成分分析，研制生产出发酵型香蕉复合果汁饮料。通过单因素试验和响应面优化试验确定最佳发酵工艺条件为香蕉浆50%，芒果汁5%，白砂糖添加量6%、佰生优益生菌果蔬酵素接种量0.04%、茶汤添加量5.0%，发酵时间5.0 d，发酵温度34 ℃，此条件下得到的香蕉复合果汁饮料色泽淡黄透亮、具有香蕉和芒果固有的浓郁香味，酸甜适中、香气清新，其可溶性固形物、可滴定酸度、蛋白质、总糖、总多酚的含量分别为16.80%、1.20 g/kg、10.90 mg/100 g、9.91 g/100 g、0.38 mg/mL。在饮料发酵过程中，总糖和总多酚含量变化较小，处于稳定状态，这表明发酵型香蕉复合果汁中所含有的总糖以及总多酚含量得以保留，而可滴定酸度和蛋白质含量呈上升状态，这可能是添加的佰生优益生菌果蔬酵素发酵菌代谢活动所致，有助于香蕉复合果汁饮料营养价值的提高。
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