中医传统就有“五色养五脏，黑色入肾经”的说法，因此“药、食兼用”的黑色农产品一直以来深受追捧。黑米是一种药、食兼用的大米，长期食用可延年益寿，自古以来就有“药米”、“贡米”、“寿米”的美誉[1]。黑米中蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素及维生素B1等含量均高于普通稻米[2]，黑米种皮中的黄酮花色苷类物质是主要的生物活性物质，具有降低血脂、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抑制动脉粥样硬化等多种生理功效[3-5]。黑豆有豆中之王的美称，黑豆含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、尼克酸、胡萝卜素、微量元素和粗纤维，其中蛋白质含量达48%，高于其他豆类[6]，黑豆中的异黄酮、花青素及丰富的维生素等成分，具有抗氧化、调节激素水平、防癌抗癌、抗肥胖、降血脂等功效[7-10]。黑木耳是一种食药用真菌植物，子实体含有丰富的营养物质，如蛋白质、糖类、各种微量元素和维生素，同时还含有一些功能成分，如卵磷脂、甘露聚糖、木糖等，被誉为“素中之荤”[11-12]，是我国传统的保健佳品。黑色素和多糖是黑木耳的主要活性成分，黑色素具有抗氧化、抗病毒、抗衰老和增强人体免疫力等保健功能[13]，黑木耳多糖具有降血脂、抗血栓、抗衰老、抗肿瘤、抗凝血、增强免疫等作用[14-15]。
木糖醇作为功能性甜味剂，具有低糖、低脂、低热量的特点，能促进肝糖元合成，且不会引起血糖值升高，并促进人体对钙、铁的吸收，改善新陈代谢，对糖尿病患者起着营养剂和辅助治疗剂的作用[16]。因此，本研究以黑米、黑豆和黑木耳三种黑色农产品为原料与牛乳混合发酵，将发酵乳的营养成分与药食同源黑色农产品特有的药理成分互补，以木糖醇代替蔗糖，制成豆香、米香、奶香交融，兼具黑木耳清香的风味独特的益生菌发酵乳，既能满足消费者对发酵乳制品的营养保健需求，又能解决惧“糖”消费者的健康需求，对于开发糖尿病人食用的功能性食品具有重要学术价值和生产实践指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑米、黑豆、黑木耳：市售；鲜牛乳（成分指标蛋白质3 g/100 mL、脂肪3.7 g/100 mL、碳水化合物4.8 g/100 mL、Na 0.62g/100mL、Ca1g/100mL）：内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcusthermophiles）：安琪酵母股份有限公司；木糖醇（8%）：河南乐泰食品有限公司；α-淀粉酶（4 000 U/g）：北京双旋微生物培养基制品厂；糖化酶（100 000 U/g）：张家港市金源生化有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯）、琼脂（生化试剂）：广州合诚实业有限公司；Na2CO3、柠檬酸（均为分析纯）：沈阳久野化工原料有限公司。
1.2 仪器与设备
CRS 300实验室乳化机：上海新浪轻工机械设备有限公司；BJ-500A型高速多功能粉碎机：上海拜杰实业有限公司；50型胶体磨：广州正硕机械设备科技有限公司；ScienTZ-04均质机：宁波新艺生物有限公司；75型酸奶发酵柜：天津特斯达食品机械科技有限公司；GNP 9080恒温培养箱：常州菲普实验仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 低糖复合发酵乳的加工工艺流程及操作要点[17-18]
黑米液制备：筛选籽粒饱满的黑米，置于160 ℃烤箱，烘烤时间8 min，使其散发出浓郁的米香味，将烘烤后的黑米加水调整料水比为1∶5（g∶mL），然后在60～65 ℃浸泡3 h后磨浆，80 ℃糊化30 min，用饱和Na2CO3溶液调节糊化液pH值为6.5～7.0，加入0.35% α-淀粉酶95 ℃液化1 h，采用滴定方法以碘液检验还原糖含量为16%～19%，后煮沸5～10 min灭酶，冷却，用10%柠檬酸溶液调节pH值为4.0～4.5，加入0.30%糖化酶在65 ℃进行糖化4 h，用无水乙醇检验至无白色沉淀后，测其还原糖含量为75%～80%，经85 ℃、10 min热处理灭酶，过80～100目筛制得黑米液，最后用饱和Na2CO3调节其pH值为6.4～6.8，备用。
黑豆液的制备：筛选豆粒饱满的黑豆清洗两遍，用烤炉调至温度180 ℃烘烤10 min，待表皮开裂，7～8成熟，无豆腥味时取出摊凉。加水调整料水比为1∶5（g∶mL），在20～25 ℃浸泡10 h后进行磨浆，磨好的豆浆进行湿热100 ℃、30 min 处理，去除豆皮产生的涩味，冷却后120目过滤，即得黑豆液。
黑木耳液的制备：筛选朵实均匀的黑木耳为原料，用适量水浸泡至充分吸水膨胀后，摘除根部，用水清洗干净后沥干，放入温度45～60 ℃烘箱烘干，烘干后放入粉碎机中粉碎，过60目筛，将黑木耳粉原料按料水比1∶5（g∶mL），置于75 ℃恒温水浴中超声浸提（120 W、100 kHz）90 min，过80～100目筛制得黑木耳液。
混合液：将上述制得的黑米液、黑豆液、黑木耳液按一定比例混合，备用。
均质、杀菌：将制备好的黑米黑豆黑木耳混合液：鲜牛乳按一定比例混合后，加入2%～10%木糖醇，0.3%羧甲基纤维素钠和琼脂（1∶1）复配型稳定剂，搅拌均匀后用均质机均质（压力25 MPa，温度50～65 ℃），在90～95 ℃杀菌5～10 min，再冷却至42 ℃。
接种发酵：加入混合发酵剂保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶2，发酵剂添加量为2.5%～4.5%，搅拌均匀，将混合液置于42 ℃恒温条件下，发酵4 h，待凝乳酸度达到70°T以上即为发酵完成。将发酵完成的发酵乳置于4 ℃冰箱中冷藏24 h进行后熟，即得成品。
1.3.2 低糖复合发酵乳发酵工艺优化单因素及正交试验
参照上述低糖复合发酵乳制备工艺，设计黑米黑豆黑木耳质量比分别为1∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶3、3∶2∶1、3∶3∶1；黑米黑豆黑木耳混合液∶牛乳体积比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5；接种量分别为2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%；木糖醇添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%，考察黑米黑豆黑木耳质量比、黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比、接种量、木糖醇添加量对低糖复合发酵乳品质的影响。
利用单因素优化的结果，依据低糖复合发酵乳的发酵条件及菌种的生长特性，以黑米∶黑豆∶黑木耳质量比（A）、混合液∶牛乳体积比（B）、接种量（C）、木糖醇添加量（D）为考察因素，进行L9（34）的正交试验设计，通过对发酵乳酸度及感官评分为考察指标，确定低糖复合发酵乳的最佳发酵工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 低糖复合发酵乳发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of low sugar compound fermented milk
1.3.3 复合发酵乳理化及微生物指标测定
黑米液还原糖的测定参考GB 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；酸度的测定采用GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》中的中和滴定法；pH值测定采用pH计；蛋白质的测定采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；脂肪的测定采用GB 5413.3—2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》中的索氏抽提法；乳酸菌活菌数的测定采用GB 4789.35—2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》中的平板计数法。
1.3.4 黑米黑豆黑木耳低糖复合发酵发酵乳感官评价方法[19-20]
选择20名感官评定专业人员组成评定小组，分别从低糖复合发酵乳的组织状态（30分）、口感（30分）、风味（20分）、色泽（20分）四个方面对产品进行感官评定，满分为100分，具体评价标准见表2。
表2 低糖复合发酵乳感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of low sugar compound fermented milk
1.3.5 数据统计与分析
所有试验检测指标均重复测定3次，数据表示为平均值±标准偏差，使用SPSS 20.0软件进行数据统计和分析；使用方差分析邓肯法对数据的显著性差异进行分析，当P＜0.05时，认为各均值之间差异显著；使用皮尔逊法对数据之间的相关性进行分析。
2 结果与分析
2.1 黑米黑豆烘烤条件
高温烘烤可以使黑米黑豆产生浓郁的米香及豆香，去除豆腥味，使得复合发酵乳具有浓郁的烘焙香味，有利于黑米糊化及黑米淀粉的降解，温度适宜黑米、黑豆表皮无脱落，表皮中的黑色素成分对发酵乳的功能性提升起显著作用。
表3 烘烤条件对黑米感官评价的影响
Table 3 Effects of baking conditions on sensory evaluation of black rice
由表3可见，黑米烘烤温度太低，产生的香味较淡；烘焙温度太高，容易产生焦糊的味道且易于造成表皮脱落，因此黑米最佳烘烤温度为160 ℃，烘烤时间为8 min，此时黑米香气浓郁，无表皮脱落现象。
表4 烘烤条件对黑豆感官评价的影响
Table 4 Effects of baking conditions on sensory evaluation of black beans
由表4可知，黑豆烘烤温度太低，香味不浓郁，且豆腥味较明显；烘烤温度太高，焦味明显，表皮脱落严重，因此黑豆最佳的烘烤温度为180 ℃，烘烤时间为10 min，此时黑豆香味浓郁，无焦味，无豆腥味，几乎无表皮脱落现象。
2.2 低糖复合发酵乳发酵工艺优化单因素试验
2.2.1 黑米黑豆黑木耳质量比对发酵乳品质的影响
在黑米黑豆黑木耳混合液∶牛乳体积比为6∶4，木糖醇添加量为8%，混合菌种接种量为4.0%时，考察黑米黑豆黑木耳质量比对发酵乳品质的影响，结果见图1。
图1 黑米黑豆黑木耳质量比对低糖复合发酵乳酸度及感官评分的影响
Fig.1 Effects of mass ratio of black rice,black beans and black fungus on acidity and sensory score of low sugar compound fermentation milk
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着黑米液比重增加发酵乳酸度值及感官评分均呈现升高趋势，因为黑米在经过酶解处理后产生寡糖作为乳酸菌发酵底物被充分利用，乳酸菌加速增长，因此发酵乳的酸度有上升的趋势；减少黑木耳液比重反而使发酵乳的风味突出，原因在于高含量的黑木耳的清香味道掩盖了部分米香及豆香味；当黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1时，发酵乳米香、豆香、黑木耳清香与牛乳香气交融，口感爽滑细腻，组织状态好，发酵乳感官评分达最高（89±1.5）分，酸度值为（84±1.3）°T。当黑豆液比重逐渐升高至黑米、黑豆量相等时，即黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1时，发酵乳液中有细微颗粒沉淀，乳液中固形物质含量也随之增加，导致水分活度明显降低，菌体产酸能力下降，因此，最适的黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1。
2.2.2 黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比对发酵乳品质的影响
在黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1，木糖醇添加量为8%，混合菌种接种量为4.0%时，考察黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比对发酵乳品质的影响，结果见图2。
图2 混合液与牛乳体积比对发酵乳酸度及感官评分的影响
Fig.2 Effects of volume ratio of mixed liquid and milk on acidity and sensory score of low sugar compound fermentation milk
由图2可知，随着黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比降低，发酵乳酸度值保持下降趋势，感官评分先升高后下降，原因在于黑米经液化糖化后把溶解状态的淀粉、糊精转化为可发酵性寡聚糖，有利于乳酸菌发酵，酸度值较高；通过添加适当牛乳以缓解沉降或稀释速度，发酵乳的胶凝能力增强，发酵乳的黏稠度提高，乳清析出现象逐渐减少，发酵乳感官评分逐渐升高，当黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为6∶4（V/V）时，发酵乳口感细腻爽滑，组织状态均匀一致，无乳清析出，凝固状态良好，酸度适宜，发酵乳感官评分达最高（92±1.5）分；当黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为5∶5 时，发酵乳组织状态均匀度较差，有粉感及砂质感，感官评分下降。因此，最适的黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为6∶4（V/V）。
2.2.3 接种量对发酵乳品质的影响
黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1，黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为6∶4，木糖醇添加量为8%，考察混合菌种接种量对发酵乳品质的影响，结果见图3。
由图3可知，随着混合菌种接种量的增加，发酵乳的酸度呈现升高的趋势，感官评分呈现先升高后下降趋势，原因在于接种量太少会导致发酵不完全，乳酸产量不够，酸味较淡，风味一般，发酵乳易于分层，凝乳较差；当接种量达到4.0%时，发酵乳酸甜适口，口感适宜，凝乳状态好，质地均匀，风味独特，此时感官评分达到最高（91±1.4）分，酸度值为（78±1.3）°T；接种量太大乳酸产量过多，使得酸度过大，反而易造成凝乳中蛋白质脱水收缩现象，使乳清析出较多，发酵乳的口感和风味略差。因此，最适的混合菌种接种量为4.0%。
图3 接种量对低糖复合发酵乳酸度及感官评分的影响
Fig.3 Effects of inoculum on acidity and sensory score of low sugar compound fermentation milk
2.2.4 木糖醇添加量对发酵乳品质的影响
黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1，黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为6∶4，混合菌种接种量为4.0%，考察木糖醇添加量对发酵乳品质的影响，结果见图4。
图4 木糖醇添加量对低糖复合发酵乳酸度及感官评分的影响
Fig.4 Effect of xylitol addition on acidity and sensory score of low sugar compound fermentation milk
由图4可知，随着木糖醇添加量的增加，发酵乳的酸度及感官评分均呈现先升高后下降趋势，因为一定浓度的糖分能加速乳酸菌生长，提高酸乳的风味和口感；当木糖醇含量达6%时发酵乳酸度突出，甜度略差，失去发酵酸乳特有的风味；随着木糖醇含量增加反而抑制乳酸菌产量导致酸度下降，当木糖醇含量为8%时，此时发酵乳酸甜适口，组织状态良好，此时感官评分最高达（91±1.5）分；木糖醇含量过高达10%时发酵乳略甜，酸度不足，口感欠佳。因此，最适的木糖醇添加量为8%。
2.3 低糖复合发酵乳发酵工艺条件优化正交试验
以黑米黑豆黑木耳质量比（A）、黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比（B）、混合菌种接种量（C）、木糖醇添加量（D）为研究对象，以发酵乳的感官评分为考察指标，按照正交设计L9（34）进行正交试验，对低糖复合发酵乳发酵工艺条件进行优化，正交试验结果与分析见表5。
表5 低糖复合发酵乳发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of fermentation process of low sugar compound fermented milk
由表5可知，影响低糖复合发酵乳感官评分的因素主次顺序为：A＞B＞C＞D，即黑米黑豆黑木耳质量比＞黑米黑豆黑木耳混合液牛乳体积比＞接种量＞木糖醇添加量。黑米黑豆黑木耳质量比对复合发酵乳的感官评分影响显著（P＜0.05）。最优组合为A2B2C2D2，即黑米黑豆黑木耳质量比为3∶2∶1，黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比为6∶4，接种量为4.0%，木糖醇添加量为8%。在此优化工艺条件下进行3次平行验证试验，低糖复合发酵乳感官评分为94.2分。
2.4 低糖复合发酵乳理化及微生物指标检测结果
参照GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》，对经优化工艺制备的低糖复合发酵乳的理化指进行检测，低糖复合发酵乳成品感官评分为94.2分，其脂肪含量为3.6%；蛋白质含量为5.9%；酸度为79°T；还原糖含量为5.2%；全乳固体为16.1%；乳酸菌数为1.91×106 CFU/g；大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌未检出。
3 结论
通过试验研究确定黑米黑豆黑木耳低糖复合发酵乳的最佳工艺条件为黑米黑豆黑木耳质量比3∶2∶1，黑米黑豆黑木耳混合液与牛乳体积比6∶4，接种量4.0%，木糖醇添加量8%。在此优化工艺条件下，低糖复合发酵乳的感官评分为94.2分，脂肪含量为3.6%，蛋白质含量为5.9%，酸度为79°T，含糖量为5.2%，全乳固体为16.1%，乳酸菌数为1.91×106 CFU/g，未检出致病菌，该产品具有发酵乳原有的风味及营养价值，兼具米香、豆香、奶香及黑木耳的清香味道，减少发酵乳中的脂肪及含糖量，增加蛋白质含量，可满足对食品低脂肪、低糖、低热量、高蛋白的现代市场需求，提升了黑色农产品的附加值，有着极大的保健食品开发市场潜力。
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