柠檬（Citrus lemon（L.）Burm.F.）为芸香科柑橘属常绿小乔木，在世界柑橘业排名中居于第三位，年产量大约是世界柑橘总产量的10%[1]。我国柠檬年产量大约为80 000～100 000 t，占柑橘总产量的1%左右[2]。目前，世界各国的柠檬大多用于鲜食，而加工量只占总产量的20%左右，主要加工产品为柠檬浓缩果汁、原果汁、柠檬香精油以及从柠檬皮中提取果胶和膳食纤维等[3-6]。目前，国内研究较多的有尤力克、费米耐劳、香柠檬等主要栽培品种[7-9]，沃尔卡姆柠檬（Citrus volkameriana）外观似橘子，具有宜人的香气和风味，其味酸、略苦，皮薄多汁，富含维生素C、柠檬酸等，但对于其果实的相关研究尚处于空白。
果汁加工中的风味变化一直都是研究的热点，而灭菌是果汁加工中不可或缺的操作工序，当前较为理想的杀菌方式有巴氏杀菌、微波杀菌、超声波杀菌。超声波是一种新型的食品工艺杀菌技术，具有高效、节能、低温、营养成分损失少等多种优点，能够较好地解决传统加工过程中存在的营养流失和褐变问题。微波的优点是在达到杀菌效果的同时，确保了重要营养素等品质的最小损失。巴氏灭菌（≤100 ℃）是果汁加工中最常用的灭菌方式，国内工厂常用（80 ℃、10 min），传统巴氏杀菌（65 ℃、30 min）虽能达到良好的杀菌效果，但对果汁的色泽和营养品质造成一定程度的不良影响。AGUILAR-ROSAS S F等[10]研究显示，热力灭菌（90 ℃、30 s）会引起苹果汁香气成分的显著减少。王珺等[11]用顶空固相微萃取-气相质谱联用法（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）对不同灭菌方式（超高压400 MPa、10 min；热杀菌100 ℃、5 min；不杀菌）处理酶法去皮甜橙全果的挥发性风味进行了分析，结果表明灭菌后挥发性风味物质的种类都有所降低，但是也生成了多种香气物质。
目前，有关巴氏灭菌对沃尔卡姆新鲜柠檬原汁挥发性成分的影响鲜见报道。本实验以新鲜的沃尔卡姆柠檬汁为研究对象，将新鲜柠檬汁在80 ℃条件下加热10 min进行巴氏灭菌，并采用HS-SPME-GC-MS联用技术对巴氏灭菌前后的柠檬汁样品的挥发性成分进行分析，探究巴氏灭菌对新鲜柠檬汁中挥发性成分的影响，旨在为沃尔卡姆柠檬果汁筛选合适的灭菌方法及提高果汁品质提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沃尔卡姆柠檬：重庆上田生态农业开发有限公司；NaCl（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
QP2010型GC-MS联用仪：日本岛津公司；手动固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）进样器：美国珀金-埃尔默公司；50/30 μmDVB/CAR/聚二甲基硅氧烷PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；HH-6型数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；FA2004A电子天平：上海精天电子仪器厂；JYZ-E96型螺旋榨汁机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 新鲜沃尔卡姆柠檬原汁的制备
将新鲜的沃尔卡姆柠檬去皮、去籽，用榨汁机进行冷榨，所得原汁用200目尼龙布进行过滤，得到新鲜的柠檬原汁。
1.3.2 巴氏灭菌条件
分别量取新鲜的沃尔卡姆柠檬原汁各100 mL，分装于2个150 mL锥形瓶中，密封，一个作为果汁未灭菌组，另一个置于水浴锅中80 ℃条件下加热10 min，取出后迅速进行流水冷却，作为果汁灭菌组。
1.3.3 沃尔卡姆柠檬汁的挥发性成分萃取
沃尔卡姆柠檬中挥发性成分的提取采用顶空固相微萃取法。分别量取柠檬汁5 mL加入20 mL萃取瓶中，加入1.5 g NaCl，密封后插入萃取针，置于50 ℃水浴锅中，平衡10 min后推出萃取针头，顶空萃取30min，然后将萃取头插入GC-MS进样口，解吸5 min。
1.3.4 沃尔卡姆柠檬汁挥发性成分的GC-MS分析[12-14]
GC条件：DB-5MS 色谱柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；柱箱温度40 ℃；进样口温度230 ℃；升温程序：40 ℃保持3 min，以7 ℃/min升至130 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃；载气为氦气（He）；流速1.00 mL/min；压力49.5 kPa；不分流。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃；溶剂延迟时间1 min；质量扫描范围35～500 m/z；扫描速率1 000 amu/s。
1.3.5 定性定量分析
通过计算机谱库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08s进行检索，与标准质谱进行对照并结合相关参考文献进行定性分析，运用峰面积归一化法确定各挥发性成分的相对百分含量。
1.3.6 数据处理
利用Excel 2013进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 巴氏灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁挥发性成分的总离子流色谱图
采用HS-SPME方法对巴氏灭菌前后柠檬汁的挥发性成分进行萃取，经GC-MS联用仪进行分析鉴定，得出柠檬汁挥发性成分的总离子流色谱图见图1，各挥发性成分含量GC-MS分析结果见表1。
图1 巴氏灭菌前（a）、后（b）沃尔卡姆柠檬汁挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds in Volkamer lemon juice before (a) and after (b)pasteurization by GC-MS
从表1可以看出，采用HS-SPME-GC-MS联用技术检测并运用计算机谱库（NIST08）进行检索，结合相关参考文献可初步定性灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁中分别有86种和94种挥发性成分。醇类与烷烃类是新鲜沃尔卡姆柠檬汁主要的挥发性成分。巴氏灭菌以后沃尔卡姆柠檬汁中挥发性风味物质的整体数量和相对含量均发生了不同程度的改变。
未灭菌的新鲜沃尔卡姆柠檬汁中，共检测出86 种挥发性成分，占总峰面积的98.18%。其中，烷烯类77%，醇类18.56%，酯类1.47%，醛酮类1.88%。主体挥发性成分为柠檬烯（30.35%）、萜品油烯（11.75%）、β-蒎烯（7.37%）、α-松油醇（6.21%）、4-萜烯醇（5.15%）、月桂烯（3.81%）、香茅醇（3.69%）、1-β-红没药烯3.43%、2-莰烯（2.79%）和（+）-α-柏木萜烯（2.11%）等。
表1 巴氏灭菌前后沃尔卡姆柠檬果汁挥发性风味成分的GC-MS分析结果
Table 1 Analysis results of volatile flavor components in Volkamer lemon juice before and after sterilization by GC-MS
续表
续表
注：“-”表示未检出。
巴氏灭菌后的沃尔卡姆柠檬汁中，共检测出94 种挥发性成分，占总峰面积的99.45%。其中，烷烃类66.23%、醇类27.71%、酯类2.33%、醛酮类1.48%。其主体挥发性成分为柠檬烯（27.89%）、α-松油醇（11.62%）、萜品油烯（10.94%）、4-萜烯醇（6.62%）、β-蒎烯（5.27%）、（R）-（+）-β-香茅醇（4.97%）、月桂烯（3.22%）、2-莰烯（2.8%）、1-β-红没药烯（2.64%）和（+）-香橙烯（1.87%）等。
2.2 巴氏灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁中主要呈香物质分类比较
如图2所示，巴氏灭菌处理后，沃尔卡姆柠檬汁的主体挥发性及其相对含量发生了不同程度的变化。灭菌后的沃尔卡姆柠檬汁中，醇类和酯类物质的相对含量较灭菌前分别增加了9.15%与0.86%；而烷烯类、醛酮类挥发性成分的相对含量出现不同程度的降低。
2.2.1 烷烃类挥发性物质的比较
由图2可知，烷烯类物质是沃尔卡姆柠檬汁的主要挥发性成分，其中相对含量较高的柠檬烯、β-蒎烯、月桂烯、1-β-红没药烯及2-莰烯的相对含量在灭菌前后都超过2%。烷烃、烯烃类物质比醇类和酯类含量多。灭菌前后的沃尔卡上柠檬汁中检出的烷烯类物质种类及含量都相对较多，种类分别为48和51种，相对含量分别为77%和66.23%，灭菌前后共有的挥发性成分只有34 种。
图2 巴氏灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁中挥发性风味成分种类及相对含量
Fig.2 Types and relative contents of volatile flavor components in Volkamer lemon juice before and after pasteurization
未灭菌组和灭菌组均检出柠檬烯、α-蒎烯（松木味）、α-萜品烯（柑橘香味）、D-苧烯（柚香味）、异松油烯（柠檬气味）、1-石竹烯（丁香花气味）、巴伦西亚橘烯（柑橘香气）、雪松烯、丁香烯、月桂烯、（+）-香橙烯等挥发性成分。柠檬烯的化学性质非常活泼，在与氧气接触下可自动氧化成一系列的氧化单环单萜，如香芹酮、柠檬烯-1,2-氧化物、柠檬烯氢过氧化物等；柠檬烯在酸的催化条件下发生水合反应可生成α-松油醇[15]，这些化学反应都会引起柠檬烯的损失。巴氏灭菌的温度条件及柠檬原汁较低的pH值促进了一系列氧化反应和水合反应的进行，造成了柠檬烯的损失。α-蒎烯很早被证实对橙类的风味有积极作用，其含量与果皮精油在果汁油中的比例相关。巴伦西亚橘烯是一种半萜烯，有轻微的橙香味，在柑橘类果汁风味中均有检出，对整体风味有重要作用[16]。α-萜品烯为单环单萜类化合物，未灭菌和热灭菌条件下相对含量分别为1.20%、1.16%，这表明α-萜品烯受巴氏灭菌的影响不显著，表现出较为稳定的特性。巴氏灭菌后，β-蒎烯、月桂烯及1-β-红没药烯的相对含量均有所降低，可能是由于温度促进了一系列的反应，生成了其他物质。
2.2.2 醇类挥发性物质的比较
醇类物质的相对含量在巴氏灭菌后大幅上涨，增加了9.15%。灭菌前后的沃尔卡姆柠檬汁中分别检测到挥发性醇类物质为18和19种，其中相同的有12种。芳香醇类物质的阈值一般较低，故其香气值（浓度/阈值）较高，其对总体香气的影响不可忽视[17]。巴氏灭菌后醇类物质的相对含量有所增加，这可能是因为加热使得某些以糖苷健结合的醇类释放出来，以及氨基酸的去氨基和去碳酸基反应使得醇类物质的相对含量增加。灭菌前的柠檬汁中相对含量较高的醇类组分为α-松油醇、4-萜烯醇和香茅醇，相对含量分别为6.21%、5.15%和3.69%。巴氏灭菌后的柠檬汁中相对含量较高的醇类物质为α-松油醇、4-萜烯醇、（R）-（+）-β-香茅醇和小茴香醇，相对含量分别为11.62%、6.62%、4.97%和1.18%。
芳樟醇具有紫丁香、铃兰与玫瑰的花香，又有果香、木香气息，是柑橘类水果重要的香气成分。芳樟醇不稳定，容易降解成α-松油醇。α-松油醇具有微妙的丁香味，存在于许多水果中。柠檬烯在酸性条件下可以发生水合反应生成α-松油醇，巴氏灭菌后，α-松油醇的相对含量大幅度增加，而柠檬烯和芳樟醇的相对含量降低，说明巴氏灭菌促进了相关反应的进行。香茅醇只在灭菌前检出，而在灭菌后出现了（R）-（+）-β-香茅醇，表明巴氏灭菌可能促进了香茅醇与（R）-（+）-β-香茅醇之间的转化，二者都具有甜玫瑰香味。4-萜品醇在多种柑桔果汁中也有被检出[18]。
2.2.3 酯类挥发性物质的比较
酯类物质的种类共17 种，灭菌前后的沃尔卡姆柠檬汁中分别有10种与13种，其中相同的有6种，巴氏灭菌后生成了6种新物质。灭菌前后柠檬汁中酯类物质中相对含量最高的均为棕榈酸乙酯，灭菌前存在的一些香气成分乙二醇二丁酸酯、14-（2-辛基环丙基）-十四烷酸甲酯和硬脂酸-1-[（十四烷氧基）羰基]十五烷基酯在灭菌后均未检出。巴氏灭菌后，新生成了6种新物质，分别为乙酸薄荷酯、甲酸異莰酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、（13Z）-13-十八碳烯酸乙酯、油酸乙酯和硬脂酸乙酯。酯类物质以乙酸酯为主，其具有花香和果香的感官特性，对柠檬汁总体香气成分的形成作用不可忽视。虽然这些化合物的相对含量都不高，但由于其香气的阈值低、香气值（浓度/阈值）较高，加之其风味独特，对柠檬汁的香气形成也起着重要的作用。
2.2.4 醛酮类挥发性物质的比较
醛和酮类化合物主要是由酸的脱羧和醇的氧化形成[19]。灭菌前后的柠檬汁中共检测出醛酮类物质10种，相同的挥发性成分有2种，灭菌前柠檬汁中相对含量较高的为（9Z）-9-十八烯醛、癸醛和壬醛，其相对含量分别为1.85%、0.83%、0.56%。灭菌后相对含量较高的为壬醛、胡椒酮和β-环柠檬醛，相对含量分别为0.56%、0.48%、0.30%。壬醛，具有青而微甜、尖锐的蜜蜡花香气息。癸醛和壬醛等都是形成酯类物质的重要成分，对于柠檬果汁香气成分的形成具有很好的辅助作用。灭菌前柠檬汁中癸醛的相对含量为0.83%，但是灭菌后未检出。醛类的气味阈值较低，相对含量较低时也能影响风味，并且可以与许多物质风味相重叠，对柠檬汁整体香气起到一定的修饰作用，如β-环柠檬醛具有果香和花香气息，香气稍类似紫兰酮和鸢尾，稍有油腻气息。而酮类的阈值远高于醛类，主要由脂质氧化生成，对整体风味的贡献较为有限[20]。
2.2.5 其他类挥发性物质的比较
巴氏灭菌后，其他类挥发性物质成分增加了一种，相对含量增加量0.1%，总体上变化不大。巴氏灭菌后，壬二酸的相对含量由1.07%降到0.02%，有可能是生成了其他物质。
3 结论
采用HS-SPME与GC-MS联用技术分析巴氏灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁中的挥发性成分。灭菌前后柠檬汁中的挥发性香气成分种类和相对含量都发生了不同程度的改变。灭菌前后的柠檬汁中各自的挥发性香气成分分别为86种和94种，相同的香气成分有59种。烷烯类物质构成了柠檬汁挥发性成分的主体，其相对含量远远超过其他种类挥发性物质的相对含量。灭菌前后柠檬汁中的主要挥发性物质均为柠檬烯、萜品油烯、β-蒎烯、α-松油醇、4-萜烯醇、月桂烯、香茅醇、1-β-红没药烯、2-莰烯等。
巴氏灭菌后的沃尔卡姆柠檬汁中，醇类和酯类物质的相对含量较灭菌前分别增加了9.15%与0.86%；而烷烯类、醛酮类挥发性物质成分的相对含量出现不同程度的降低。灭菌前后沃尔卡姆柠檬汁中相对含量最高的成分都是柠檬烯，其相对含量分别为30.35%和27.89%，灭菌后挥发性成分的相对含量都有所减少，而其他一些挥发性成分如α-松油醇、4-萜烯醇、乙酸香茅酯等则有所上升。巴氏灭菌后增加了1,1-环戊二烯、（+）-环苜蓿烯、榄香烯、α-法尼烯、β-柏木烯、罗汉柏烯、1-辛醇、α-毕橙茄醇等35 种呈香物质。新鲜柠檬汁经巴士杀菌后会产生蒸煮味，在一定程度上影响果汁的风味但是巴氏灭菌后新鲜柠檬汁的主体挥发性成分没有发生太大的变化。
综上，巴氏杀菌对新鲜柠檬汁主体香气成分的影响不大，适合作为该柠檬汁的杀菌方式。但是是否有更适宜的杀菌方式能够尽可能减少柠檬汁中挥发性芳香成分的改变与损失，还需要今后更深入的研究。
[1]杨恩聪，岳建强.德宏柠檬发展概况及主要栽培技术[J].云南农业科技，2006（2）：56-58.
[2]高俊燕，朱春华，李进学，等.柠檬加工综合利用的研究进展[J].亚热带农业研究，2009，5（1）：64-68.
[3]刘义武，王碧.柠檬营养成分与综合利用研究进展[J].内江师范学院学报，2012，27（8）：46-51.
[4]韩鹏，黄雨欣，李雪梅，等.植物蛋白酶提取柠檬皮果胶[J].食品研究与开发，2015，36（4）：54-57.
[5]董丹，关统伟，雷激，等.柠檬皮渣果胶提取预处理工艺研究[J].中国酿造，2014，33（12）：80-84.
[6]王伟，马斌，高剑，等.超声波辅助法提取柠檬皮中香精油的工艺研究[J].广州化工，2016，44（12）：102-104.
[7]涂勋良，吕秀兰，李亚波，等.不同产地尤力克柠檬果皮精油成分对比分析[J].食品与机械，2016，32（4）：52-56.
[8]徐杨斌，王凯，朱瑞芝，等.香柠檬油挥发性成分的GC-TOFMS 分析[J].食品研究与开发，2015，36（22）：134-137.
[9]何朝飞，冉玥，曾林芳，等.柠檬果皮香气成分的GC-MS 分析[J].食品科学，2013，34（6）：175-179.
[10]AGUILAR-ROSAS S F,BALLINAS-CASARRUBIAS M L,NEVAREZMOORILLON G V,et al.Thermal and pulsed electric fields pasteurization of apple juice:effects on physicochemical properties and flavour compounds[J]. J Food Eng,2007,83(1):41-46.
[11]王珺，黄林华，马亚琴，等.杀菌方式对酶法去皮全果橙汁挥发性风味的影响[J].食品与发酵工业，2017，43（2）：122-128.
[12]魏维伟，杨华武，杨亚坤.全自动顶空固相微萃取分析湖南江永香柚皮中的挥发性成分[J].食品与发酵工业，2014，40（8）：201-204，208.
[13]林雯雯.超声处理对鲜榨橙汁香气物质的影响及其机理研究[D].杭州：浙江大学，2015.
[14]郭莉，吴厚玖，王华，等.贮藏过程中夏橙汁香气成分变化[J].食品科学，2011，32（22）：293-297.
[15]PÉREZ-LÓPEZ,A J,SAURA D,LORENTE J,et al.Limonene,linalool,α-terpineol,and terpinen-4-ol as quality control parameters in mandarin juice processing[J].Eur Food Res Technol,2006,222(3-4):281-285.
[16]王伟江.天然活性单萜-柠檬烯的研究进展[J].中国食品添加剂，2005（1）：33-37.
[17]郭克娜.薏米酒生产技术及质量指标的研究[D].重庆：西南大学，2013.
[18]DHARMAWAN J,KASAPIS S,CURRAN P,et al.Characterization of volatile compounds in selected citrus fruits from Asia.Part I:freshlysqueezed juice[J].Flavour Fragr J,2007,22(3):228-232.
[19]JULIANE EW,MAURO Z,MARCELO L,et al.Quantitative analysis of headspace volatile compounds using comprehensive two-dimensional gas chromatography and their contribution to the aroma of Chardonnay wine[J].Food Res Int,2014,59:85-99.
[20]吴灿，夏延斌，唐鑫，等.莲子皮黄酒的调配及挥发性风味成分分析[J].食品与机械，2013，29（4）：29-34.