谷类杂粮制品主要是指以玉米、黑米、小米、薏米、高粱、燕麦、大麦、红米、红稗等杂粮蒸煮或者粉碎制得的食品，营养丰富，富含多种维生素、矿物质和膳食纤维。但是，同样这些杂粮在生长过程中也会受到易病虫害危害产生真菌毒素，从而影响产品产量和质量、埋下食品安全隐患[1]。目前对粮谷的真菌毒素报道很多[2-6]，对谷类杂粮制品的研究较少，特别是在3种呕吐毒素类-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-acetyldeoxyn-ivalenol，15-ADON）以及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）等真菌毒素方面鲜有报道。CASTILLO M D等[7]研究发现，黑豆可能存在链格孢霉毒素、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和单端孢霉烯族毒素的污染风险；TSENG T C等[8]在赤豆和绿豆中检测到了伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1）。
目前，真菌毒素检测的方法主要有薄层色谱法、酶联吸附免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[9-12]。薄层色谱法对检测仪器及人员要求较低，但是此方法精度较差、实验步骤冗长繁多、重现性不好[13]；酶联免疫吸附试验法具有灵敏、快速等优点，但是存在交叉污染反应的缺点[14]；高效液相色谱法应用较为广泛，检测稳定性较好，但样品中基质易对目标物产生干扰，前处理过程繁琐，对操作人员要求高，且采用的免疫亲和柱成本较昂贵[15]。鉴于上述方法存在的前处理中有些步骤和条件的缺陷，或者易定性误判等不足，本研究尝试运用QuEChERS前处理净化技术，简化提取过程，建立快速、容易、便宜、有效、稳定和可靠（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe，QuEChERS）的净化技术结合高效液相色谱-质谱联用法检测谷类杂粮制品中DON、3-ADON、15-ADON 和ZON同时检测的方法，该研究对评价此类食品的安全具有重要意义，也为谷类杂粮制品中真菌毒素的分析和监控提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DON溶液标准品（100 μg/mL）、3-ADON溶液标准品（100 μg/mL）、15-ADON溶液标准品（100 μg/mL）、ZON溶液标准品（100 μg/mL）：中国计量科学研究院；甲醇、乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；甲酸（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司；API 3500 QTrap超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：美国AB公司；Milli-Q纯水仪：美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Zorba-C18柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流速：0.3 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为0.10%甲酸溶液，B为乙腈；洗脱条件见表1。
表1 HPLC-MS/MS梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions of HPLC-MS/MS
1.3.2 样品的提取与净化
称取1.0 g混合盐析剂置于10 mL离心管中，加入2.0 g样品，加入4.0 mL提取溶液。取1 mL上清液于2.0 mL PE管中，加入吸附剂后涡旋10 s，离心取上清液，过膜后上机进样分析。实验分别比较不同的提取溶液以及吸附剂组合，对4种真菌毒素检测的影响。其中提取液分别比较了提取溶液Ⅰ（甲醇∶水=20∶80，V/V）、提取溶液Ⅱ（甲醇∶水=10∶90，V/V）、提取溶液Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，V/V）、提取溶液Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，V/V）共4种，对目标物提取的影响；吸附剂比较了C18、Florial、SAX、GCB、Al2O3、PSA共6种以及未使用吸附剂时对目标物提取的影响，并在上述优化基础上比较C18+无水硫酸镁粉末（100 mg+300 mg）、Florisil+无水硫酸镁粉末（100 mg+300 mg）和Florisil+C18+无水硫酸镁粉末（50 mg+50 mg+300 mg）共3种配比，来优化QuEChERS吸附剂组合。
1.3.3 标准溶液的配制
DON、3-ADON、ZON用乙腈配制成1.0 μg/mL的标准储备液，15-ADON用乙腈配制成10.0 μg/mL的标准储备液，置于4 ℃冰箱中储存。
1.3.4 方法的精密度、重复性与回收率
以未检出4种真菌毒素的谷类杂粮样品为空白基质，加入不同浓度的DON、3-ADON、15-ADON、ZON混合标液，使用QuEChERS提取后，上机检测计算回收率。
2 结果与分析
2.1 QuEChERS前处理方法的优化
2.1.1 提取溶液的选择
呕吐毒素类（DON、3-ADON、15-ADON）的提取溶液一般采用纯水，而玉米赤霉烯酮（ZON）的提取一般采用甲醇-水或者乙腈-水体系，且在实验中发现，提取溶液与试样比为2∶1（mL∶g）时，加入盐析剂样品高速均质后不易产生乳浊液，上层提取液易过滤分层[16-18]。因此，采用4种提取溶液分别提取加标样品中的4种真菌毒素，实验结果以样品中4种真菌毒素的加标回收率来比较提取溶液效果，结果见图1。
图1 提取溶液对4种真菌毒素回收率的影响
Fig.1 Effect of extraction solution on recovery rates of four mycotoxins
由图1可知，含20%有机相的提取液对呕吐毒素类提取效果不佳，含10%的有机相提取液效果较好，其中提取溶液Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，V/V）的提取效果最优，4种真菌毒素的加标回收率都能达到90%以上，在此比例的提取溶液条件下，既能保证呕吐毒素类毒素的活性，又能提高4种目标物在提取液中的分配系数。
2.1.2 吸附剂的优化
本试验对比了混合标准溶液经过6种不同吸附剂和未使用吸附剂时各真菌毒素的回收率[19-20]，结果见图2。
图2 4种真菌毒素经不同吸附剂处理后的回收率
Fig.2 Recovery of four mycotoxins treated with different adsorbent
由图2可知，C18和Florisil对4种真菌毒素的回收率均较好，均在70%以上，而其他4种吸附剂净化后的真菌毒素回收率较低，因此，本试验选择C18和Florisil填料作为QuEChERS净化的吸附剂。
一般QuEChERS净化处理中会添加无水硫酸镁粉末，起到除水的作用，以提高目标物的响应值，所以试验比较了3种QuEChERS吸附剂组合对回收率的影响，结果见图3。
图3 4种真菌毒素经不同吸附剂组合处理后的回收率
Fig.3 Recovery of four mycotoxins treated with different adsorbent combination
由图3可知，Florisil+C18+无水硫酸镁粉末（50 mg+50 mg+300 mg）组合对4种真毒毒素的回收率较高，主要因为Florisil能吸附强极性组分与C18能吸附弱极性组分，两者形成互补，并添加了无水硫酸镁，起到除水的作用，所以本试验选择该组合作为吸附剂组成。
2.2 流动相的选择
呕吐毒素类以及玉米赤霉烯酮属于极性化合物，因此选择水和乙腈作为流动相的基础溶剂，为了促进样品的离子化，本实验比较了水相分别为0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸铵对4种真菌毒素分离效果的影响。实验结果发现，加入0.1%甲酸时，4种目标物的离子丰度最强，分离度较好，因此选择浓度为0.1%甲酸为水相，与乙腈组合组成流动相进行梯度洗脱，得到ZON、DON、与3-ADON和15-ADON在色谱分析图上有很好的分离度，4种目标物的离子丰度都较强，无杂质干扰，色谱图见图4。
图4 混合标准溶液色谱图
Fig.4 Chromatogram of mixture standard solution
由图4可知，4种目标化合物得以很好的分离。
2.3 质谱条件的选择
用质量浓度为50 ng/mL的混合标准溶液，对目标物进行一级和二级质谱扫描，并优化质谱参数。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数，采用多反应监测扫描模式进行优化参数，4种化合物优化后的质谱分析参数见表2。
表2 4种真菌毒素的多反应监测扫描模式的质谱参数
Table 2 Mass spectrometric parameters for monitoring the scanning patterns of four mycotoxins with multiple reactions
注：“*”表示定量离子。
2.4 方法的线性范围、检出限与定量限
在0.10%甲酸-乙腈流动相体系中，按照1.3.2方法进行前处理，得到空白基质提取液，用空白基质提取液稀释，配制混合标准溶液，以表1梯度洗脱的步骤，经仪器进行分析，绘制标准曲线，结果见表3。
表3 4种真菌毒素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限
Table 3 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of four mycotoxins
由表3可知，4种真菌毒素在上述各自的质量浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999。4种真菌毒素的检出限分别为DON 0.3 μg/kg、3-ADON 0.4 μg/kg、15-ADON 2.0 μg/kg、ZON 0.2 μg/kg，定量限分别为DON 1.0 μg/kg、3-ADON 1.5 μg/kg、15-ADON 6.0 μg/kg、ZON 0.8 μg/kg。
2.5 方法的回收率与精密度
在加标回收实验中，选用杂粮粥、杂粮饭、杂粮代餐粉3种空白基质的样品，分别添加1倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的三个水平的标准品，每个结果测定5次，进行加标回收的试验，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表4。
表4 方法的回收率试验结果
Table 4 Results of recovery rate of the method
由表4可见，4种真菌毒素DON、3-ADON、15-ADON、ZON在不同基质中的回收率范围为85.1%～102.0%，RSD为2.11%～6.22%，说明本实验的检测数据的准确度和精密度可行。
2.6 实际样品的检测
应用本方法对10份谷类杂粮制品进行检测，以保留时间和碎片离子定性，外标法定量。结果表明，其中2份样品均有检出不同浓度的DON，含量分别110.3 μg/kg和260.5 μg/kg，均未超过国家标准规定的限量要求，除此以外的3种真菌毒素均未检出。
3 结论
本研究建立了一种QuEChERS-HPLC-MS/MS检测谷类杂粮制品中DON、3-ADON、15-ADON、ZON 4种真菌毒素的分析方法。实验结果表明，样品经乙腈/水（10∶90，V/V）进行提取后，经Florisil+C18+无水硫酸镁组合吸附剂处理后，可有效去除谷类杂粮制品中的干扰物对目标峰的影响，实现对4种真菌毒素的净化，在质谱检测器的多反应监测模式下，可实现同时对谷类杂粮制品中4种真毒毒素的定性和定量分析。在3种谷类杂粮样品基质中的加标回收率为85.1%～102.0%之间，相对标准偏差（RSD）在2.11%～6.22%之间，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测谷类杂粮样品基质中的4种真菌毒素的含量。
[1]侯广月，杜营，杨帆，等.谷物及其制品中真菌毒素的前处理及检测技术研究进展[J].食品科学，2019，40（8）：306-310.
[2]赵英莲，张梓琪，赵鑫，等.QuEChERS 技术在食品真菌毒素检测中的研究进展[J].中国酿造，2020，39（1）：1-5.
[3]TURNER NW,BRAMHMBHATT H,SZABOVEZSE M,et al.Analytical methods for determination of mycotoxins:An update(2009-2014)[J].Anal Chim Acta,2015,901(2):12-33.
[4]庞世琦，刘青，李志勇.胶体金技术快速测定葡萄酒中赭曲霉毒素A[J].食品安全质量检测学报，2016，7（8）：3073-3076.
[5]张思思，陆继伟，王少敏，等.国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7（7）：2575-2586.
[6]王文珺，刘怡菲，韩霄，等.玉米赤霉烯酮一步ELISA 法的建立及应用[J].食品工业科技，2016，37（14）：78-82.
[7]CASTILLO M D,GONZÁLEZ H H,MARTÍNEZ E J,et al.Mycoflflora and potential for mycotoxin production of freshly harvested black bean from the Argentinean main production area[J].Mycopathologia,2004,158(1):107-112.
[8]TSENG T C,TU J C,TZEAN S S.Mycoflflora and mycotoxins in dry bean (Phaseolus vulgaris) produced in Taiwan and in Ontario,Canada[J].Botanical Bulletin of Academia Sinica,2005,36(4):229-234.
[9]DUARTE S C,LINO C M,PENA A.Food safety implications of ochratoxin A in animal derived food products[J].Veterin J,2012,192(3):286-292.
[10]耿霞，赵强.基于结构转换适配体荧光法检测赭曲霉素A[J].分析科学学报，2013，29（2）：164-168.
[11]梁桂娟，张琼，杨波.高效液相色谱-荧光检测法检测大米中的赭曲霉毒素A[J].中国酿造，2008，8（5）：136-138.
[12]孙雪，郗存显，唐柏彬，等.复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6 种黄曲霉毒素和6 种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量[J].分析化学，2016，44（6）：970-978.
[13]孙伟华，杨欢，曹赵云，等.基于分散固相萃取液相色谱-串联质谱法测定大米中8 种真菌毒素[J].分析测试学报，2017，36（1）：47-53.
[14]刘青，曾广丰，王志元.QuEChERS 净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4 种脂溶性贝类毒素[J].现代食品科技，2015，31（12）：338-344.
[15]林琳.QuEChERS-HPLC-MS/MS 法检测谷物源性食品中3 种赭曲霉毒素[J].食品工业，2019，40（12）：311-314.
[16]VICTOR M D,LARA F J,GARCIA M,et al.Evaluation of dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of patulin in apple juices using micellar electrokinetic capillary chromatography[J]. Food Control,2013,31(2):353-358.
[17]ANTEP H M,MERDIVAN M.Development of new dispersive liquidliquid microextraction technique for the identification of zearalenone in beer[J].Anal Meth,2012,12(4):4129-4134.
[18]ANDRADE P D,DANTAS R R,MOURA-ALVES TLDS D,et al.Determination of multi-mycotoxins in cereals and of total fumonisins in maize products using isotope labeled internal standard and liquid chromatography/tandem mass spectrometry with positive ionization[J].J Chromatogr A,2017,1490:138-147.
[19]ALASSANE-KPEMBI I,SCHATZAMYR G,TARANU I,et al.Mycotoxins contamination:Methodological aspects and biological relevance of combined toxicity studies[J].Crit Rev Food SciNutr,2016,57(16):3489-3507.
[20]周健，许娇娇，金米聪，等.响应面试验优化QuEChERS 法提取鸡蛋中杂色曲霉毒素工艺及方法学验证[J].食品科学，2017，38（24）：288-295.