葡萄酒是通过新鲜葡萄或葡萄汁发酵（酒精发酵，苹乳发酵，陈酿）制得的酒精饮料[1]。根据颜色可分为白葡萄酒、桃红葡萄酒和红葡萄酒。近年来葡萄酒深受人们喜爱，但瓶装储存中的氧化和酸化会影响葡萄酒的感官和营养价值，限制其销售[2]。瓶装白葡萄酒对溶解在葡萄酒中的氧气特别敏感，在储存过程中易发生非酶促褐变[3-5]，且因其颜色透亮，色泽更易受褐变影响。葡萄酒褐变因单体酚在金属离子的存在下被O2氧化成半醌和醌，醌聚合产生二聚体或聚合物，从而改变了白葡萄酒的颜色，降低葡萄酒的营养价值[6-7]。此外，在葡萄酒氧化过程中，氧气被还原为过氧化氢[3，8]，后者可以通过Fenton反应形成羟基自由基与酚类黄酮结合形成深色颜料[9，14]。在储存过程中，含有1,2-二羟基苯单元（儿茶酚）或1,2-3-三羟基苯单元（如儿茶素，表儿茶素，没食子酸）是葡萄酒中最容易被氧化形成半醌和醌的成分[7]。二氧化硫（SO2）可与醌反应，将其还原为邻苯二酚或形成具有磺酸盐基团的产物[8]；还可以与过氧化氢反应，抑制芬顿反应，故被广泛用作葡萄酒的抗氧化剂[9-10]。但它们有毒且具有致敏性[11]，因此，人们希望寻找新的抗氧化剂来替代SO2或减少葡萄酒中的SO2含量。研究表示在葡萄酒中使用抗坏血酸，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），谷胱甘肽（glutathione，GSH）和甘露聚糖（mannan）或可代替SO2作为抗氧化剂。抗坏血酸可以在与酚类化合物反应之前有效地清除氧气[12]；EDTA可以与葡萄酒中的金属形成复合物以防止褐变[13]。GSH可以与酚类化合物的氧化产物-半醌反应，形成不是深色的且不易被氧化的加成产物[7，14]。甘露聚糖具有较强的抗氧化性，可以与游离色素结合保护葡萄酒的色泽，并改善了葡萄酒的蛋白质稳定性[15-16]。谷胱甘肽和甘露聚糖广泛存在于酿酒葡萄和酵母细胞中。因此，与其他抗氧化剂相比，谷胱甘肽和甘露聚糖是安全且没有毒副作用的。同时，国际葡萄与葡萄酒局（OrganizationInternationaledelaVigneetduVin，OIV）已将谷胱甘肽和甘露聚糖作为葡萄酒的可添加剂[17]。
因白葡萄酒受到消费者的欢迎，研究人员对提高葡萄酒的品质进行了许多研究。其中GSH作为替代SO2的热门选项被广泛研究[18]，而甘露聚糖因强抗氧化性，价格低廉，材料易得等优点近年也被人们广泛关注[19]。目前，添加GSH和甘露聚糖对葡萄酒酿造过程中品质的影响被广泛的研究[20-23]，但关于对瓶装葡萄酒研究很少。本研究采用CIELab法、高相液相色谱法（highphaseliquidchromatography，HPLC）、气质联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等方法考察添加甘露聚糖和GSH的瓶装白葡萄酒在储存期间的颜色指数、多酚、挥发性香气物质含量及感官品质的变化，确定最优抗氧化剂及其添加量，以期为研究不同抗氧化剂对白葡萄酒品质的影响提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2018年霞多丽干白葡萄酒：新疆张裕葡萄酒业有限公司；乙腈（色谱纯）：上海科密欧公司；实验用水为超纯水；没食子酸（纯度98.5%）、咖啡酸（纯度98%）、香豆酸（纯度98%）、儿茶素（纯度98%）、表儿茶素（纯度98%）：美国Sigma公司；谷胱甘肽（纯度98%）、甘露聚糖（纯度98%）：上海源叶生物科技有限公司；其余试剂为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HP1100高效液相色谱仪（含UVdetector紫外检测器、自动进样器、CLASS-VP工作站）、7890B-5977A型气质联用仪：美国Agilent公司；RE5000E薄膜旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；SHB-11真空泵：郑州长城工贸有限公司；PDMS/DVB/CAR萃取头：上海楚定分析仪器有限公司；UV-1750型紫外可见分光光度计：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 霞多丽干白葡萄酒的加工工艺流程及操作要点
葡萄采收→分选→除梗、压榨→调整成分→静置澄清→活化酵母→接种酵母→酒精发酵→分离陈酿倒罐→澄清→装瓶→霞多丽干白葡萄酒
操作要点：
葡萄预处理：果实采摘后需要及时进行分选、除梗、破碎，除去病果和青果，不允许残留果梗。
调整成分：除梗破碎后，将葡萄立即进行压榨分离果汁，添加60 mg/L焦亚硫酸钾。
静置澄清：为了获得新鲜澄清的葡萄汁，在发酵前通常要对葡萄汁进行静置澄清，向葡萄汁中添加果胶酶50～150 mg/L，自然澄清48 h，澄清过程需要满罐，静置温度为10～15 ℃。待葡萄汁基本澄清，浊度一般到60～200 NTU为宜。然后通过分离、过滤或离心将沉淀在底部的悬浮物分离，得到澄清葡萄汁。
活化、接种酵母：取10倍于酵母质量的温水（37 ℃），加入适量蔗糖，活化10～20 min，在添加5倍于酵母液的葡萄汁扩培2～5 h，即可实现酵母的活化。酵母接种量为200 mg/L。
酒精发酵：将澄清后的上清液接种发酵，装罐量85%左右，起酵时温度可控制在22 ℃左右，一旦开始发酵，温度立即降至18～20 ℃。发酵液面气泡明显减少，品尝无甜味时，取样检测，酒精度＞7%vol，残糖含量＜4 g/L或比重达到0.993时，表明酒精发酵结束。
分离陈酿倒罐：酒精发酵结束后降温至8～12 ℃，将上清液抽出，分离酒泥。添加50 mg/L SO2满罐陈酿7 d，温度保持低于20 ℃。陈酿完进行倒罐，将原酒与酒脚进行分离，同时调整游离SO2含量至30～40 mg/L，满容贮存。
澄清：酒脚单独收集，自然澄清或进行酒泥过滤处理。分离倒罐可能要重复若干次，葡萄酒将变得澄清。
装瓶：陈酿一段时间的澄清葡萄酒就可以装瓶，即得霞多丽干白葡萄酒。
1.3.2 不同抗氧化剂对葡萄酒品质的影响
霞多丽干白葡萄酒采用传统酿造工艺酿制而成，经过酒精发酵后不添加SO2的白葡萄酒样直接在-7 ℃条件下下冷冻3～4 d，于顶端充入氮气，置于4 ℃冷库中（避光）备用。酒样进行处理时酒精度为11.20%vol，pH值为3.49，还原糖（以葡萄糖计）1.32 g/L，总酸（以酒石酸计）7.55 g/L。酿造好的葡萄酒装入瓶中，加入不同抗氧化剂处理：①不加抗氧化剂空白处理（C）；②添加谷胱甘肽10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L（分别编号为G10、G20、G30）；③添加甘露聚糖10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L（分别编号为甘10、甘20、甘30）。最后注入氮气吹扫瓶颈并盖上软木塞，瓶装储存在24 ℃条件下，每月测量一次。
1.3.3 分析检测
（1）颜色指数的测定
颜色指数根据CIELAB法测量，在波长A为420 nm、520 nm、570 nm、630 nm条件下测定吸光度值并按公式计算[18]。L*值表示明亮度；a*值和b*值分别表示红绿色、黄蓝色；C*ab值表示色彩饱和度；Hab值表示色相角，反映色度或色调；ΔE*ab值表示颜色色差。C*ab值、Hab值及ΔE*ab值计算公式如下：
式中：A为吸光度值；X、Y和Z是根据国际光学委员会（CIE）推荐的公式计算200～700 nm波长范围内的红绿黄三原色刺激值；X0、Y0和Z0是CIE推荐的标准白光的颜色三刺激值，X0=94.825、Y0=100和Z0=107.381。
（2）单体酚的测定
单体酚的测定采用高相液相色谱法。单体酚提取[19]：取10 mL葡萄酒样，用20 mL乙酸乙酯萃取3次，有机相用薄膜旋转蒸发仪（＜40 ℃）浓缩至干后，残渣溶于10 mL色谱甲醇中，置于-20 ℃避光保存，待液相分析用。测定样品前经0.45 μm微孔滤膜过滤。
高效液相色谱条件[20]：Inertsil ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），紫外检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。梯度洗脱：流动相A：2%冰醋酸，流动相B：乙腈，流速1 mL/min。洗脱程序：0～10 min，16% B；10～25 min，20%～40%B；25～30 min，40%～0%B。采用峰面积外标法定量。
（3）总酚的测定
总酚的测定采用福林酚法[21]：在10 mL容量瓶中加入100 μL样品，7 mL水，0.5 mL的1 mol/L苯酚试剂和1.5 mL的20%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容。放置暗处1 h后在波长765 nm条件下测定。
（4）挥发性化合物的测定
挥发性化合物的测定采用气质联用法。挥发性化合物的提取[22]：在顶空瓶中加入5 mL的葡萄酒，1 g氯化钠，内标2-甲基戊酸，放入微型磁力搅拌转子，密封后置于磁力加热搅拌器中。将顶空瓶在40 ℃平衡10 min后，再萃取40 min。
气相色谱条件[23]：BP20毛细管柱（50 m×220 mm×0.25 mm）。升温程序，将萃取头插入气质进样口，解吸5 min。以3 ℃/min从50 ℃升至180 ℃，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；载气（He）流速1 mL/min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源度230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输线温度280 ℃。溶剂延迟时间3 min；质量扫描范围35～450 m/z。
定性定量方法：香气物质采用美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）质谱数据库检索，结合保留时间和参考文献进行定性分析；香气成分含量用各待测物含量以其峰面积与内标（2-甲基戊酸）峰面积之比表示。
（5）感官评定
组成10人评定小组，参照国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，对葡萄酒的外观（10%）、香味（30%）、口感（40%），整体（10%）进行评定，考察不同抗氧化剂对白葡萄酒的影响。85分以上：完美；80～85分：很好；70～79分：较好；60～69分：一般；60 分以下：不合格。去掉最高分和最低分后的平均值即为产品感官得分。
1.3.4 数据处理
每个处理测定3次。实验数据通过Excel 2007、SPSS 20.0、Origin 8.5进行汇总与统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同抗氧化剂及添加量对白葡萄酒颜色的影响
图1 不同抗氧剂添加量对白葡萄酒颜色指标的影响
Fig.1 Effects of different antioxidant addition on color indexes of white wine
由于氧化会产生的深色聚合物，干白葡萄酒的颜色会随着酒中化合物氧化程度的增加而变化。因此，酒的颜色是确定其氧化程度的重要指标。不同抗氧化剂及添加量对葡萄酒颜色指标的影响，结果见图1。
由图1（a）可知，与空白组对照，不同添加量的甘露聚糖和GSH均提高了酒体的明亮度L*值。亮度L*值最大（＞98）的分别是甘20和G20，均为20 mg/L，颜色最亮，最小的是G10，颜色最暗。综合表现，甘露聚糖在亮度提升方面的效果要好。
由图1（b）可知，色度a*值＜0表示酒样的绿色色调，与同时期空白组相比，不同添加量的甘露聚糖和GSH均降低了酒体的绿色调。随着时间的变化，酒体的绿色素增加，不同抗氧化剂的抑制不显著。相比添加量而言，添加量20 mg/L的甘露聚糖降低绿色调效果较好。
由图1（c）可知，b*值＞0值表示葡萄酒中的黄色调，其中对照酒样的b*值最大。黄色调变化主要是由于氧化酚类化合物并形成带有橙色调的稳定吡喃花色素[24-25]。研究表明，添加20 mg/L露聚糖和GSH抑制黄色调最明显，减少或增加添加量抑制效果反而不明显。
由图1（d）可知，C*ab值的大小与葡萄酒颜色的饱和度相关，实验结果显示C*ab值的变化趋势与b*值相似，都随着时间的延长呈上升趋势。干白葡萄酒的饱和度加深表示酒体的氧化程度，添加20 mg/L甘露聚糖和GSH抗氧化效果显著，提高抗氧化剂的添加量反而抗氧化效果不显著。
由图1（e）可知，H*ab值代表着色相角度的差异，H*ab值越低表明酒体越接近绿色调，数据表明干白葡萄酒在绿色调随时间变化趋势较为平缓，添加20 mg/L甘露聚糖和GSH在第6月开始H*ab值明显上升，H*ab值越接近零表明酒样的色泽明亮鲜艳，酒体越年轻，抗氧化效果明显。
由图1（f）可知，ΔE*ab值代表着样品间色差。研究认为，ΔE*ab值＞2.7，则变化在视觉上能被感知到[26]。数据显示，与对照组C相比，甘20和G20色差较明显（ΔE*ab值＞5），表明在干白葡萄酒储存期间二者的抗氧化性能较好。这些变化与白葡萄酒的视觉颜色变化的常见观察结果一致：白葡萄酒颜色黄色调增加，亮度降低。
结果表明，CIELab颜色空间能很好地评价酒样颜色在贮藏期间的变化，不同添加量的甘露聚糖和GSH酒样的颜色存在明显的差异。随着时间的延长，添加量20 mg/L的甘露聚糖和GSH抗氧化效果显著，增加了葡萄酒的明亮度（P＜0.05），其中延缓黄色调增加的效果更明显，进而保证了明度，降低了色彩的丰富度。同时，减少添加量和增大添加量会造成抗氧化性能不佳或不明显，造成抗氧化剂浪费。相比较G20，随时间延长的甘20在明亮度L*值和色差ΔE*ab值上略高，而a*值、b*值和C*ab值变化较低，抗氧化性能在酒体色泽表现更好。因此，甘露聚糖（20 mg/L）对白葡萄酒的色度具有明显的保护作用。
2.2 不同抗氧化剂对白葡萄酒酚类物质的影响
不同抗氧化剂对白葡萄酒中酚类物质含量存在影响，确定葡萄酒中酚类化合物的浓度有助于判断抗氧化剂的作用。结果见表1。由表1可知，表儿茶素、儿茶素随着时间延长浓度降低，表明葡萄酒在贮藏期间发生了不同程度的氧化，不同添加量抗氧化剂的添加均延缓了其降低的速度。与空白组对照，其中甘20和G20效果最为显著（P＜0.05），分别提高了61.9%、39.7%和67.5%、16.1%。以前在模型酒中的研究表明，在氧化条件下，表儿茶素的浓度下降速度快于儿茶素[27]。但是，在此次研究中未观察到这种现象，可能由于抗氧化剂在处理白葡萄酒中发挥了保护的作用。而甘20处理对延缓儿茶素浓度降低具有更好的效果，故而更好的对葡萄酒进行抗氧化（高于G20处理组23.6%）。而香豆酸和没食子酸的浓度都随着时间的延长而增加，其中不同添加量的抗氧化剂对没食子酸浓度的增加均高于对照组C，显著提高13.32%～56.91%，以甘20最高。但处理样品的总酚浓度和对照组相似都随着时间呈递减趋势，表明不同添加量的甘露聚糖和GSH可能对部分酚类物质存在保护作用。总体而言，抗氧化剂的添加对酒体部分酚类物质具有保护和延缓降解的作用，其中甘20的效果较为明显。
表1 不同抗氧剂添加量对白葡萄酒中酚类物质含量的影响
Table 1 Effects of different antioxidant addition on phenolic substances contents of white wine
续表
注：不同大写字母表示不同处理间差异性显著（P＜0.05），不同小写字母表示不同时间差异性显著（P＜0.05）。
2.3 不同抗氧化剂对白葡萄酒香气成分的影响
葡萄酒中存在许多挥发性化合物，它们在葡萄酒的香气和味道中起重要作用。在储存期间的不同阶段，通过气质联用法测定白葡萄酒挥发性香气成分含量的变化判断不同抗氧化剂的影响，结果见表2。如表2可知，香气成分变化显著（＞1 μg/L）的化合物共有17种，其中包括7种酯类化合物，4种醇类化合物，4种酸类化合物，以及醛酚类化合物共2种。供试酒样香气物质总量在常温下贮藏126 d仅为59.965 μg/L。与对照组C相比，除甘30外，不同添加量的甘露聚糖和GSH处理葡萄酒的香气物质总量均显著提高23.57%～62.94%（P＜0.05）。因此，甘露聚糖和GSH可显著保护瓶装葡萄酒香气化合物的损失。
表2 不同抗氧剂添加量对白葡萄酒中香气成分的影响
Table 2 Effects of different antioxidant phenolic substances contents on volatile components of white wine
续表
注：不同大写字母表示不同处理间差异性显著（P＜0.05），不同小写字母表示不同时间差异性显著（P＜0.05），-表示未检测出该香气成分。
2.3.1 酯类物质
与对照组C相比，甘20和G20处理的葡萄酒酯类总量分别显著提高1.84倍和1.92倍，其次G10、甘30和甘10分别提高为92.36%、62.94%和23.57%，而G30效果不显著，仅为3.2%。甘20和G20显著降低了己酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸异戊酯的损失，显著提高了2.97～5.77倍，其气味活度值（order activity value，OAV）＞1，很好地保留了葡萄酒原有的果香味。但不同添加量的甘露聚糖和GSH在乙酸乙酯、葵酸乙酯和乙酸己酯方面的作用并不明显，化合物含量显著下降。
2.3.2 醇类物质
与对照组C相比，不同添加量的甘露聚糖和GSH处理的葡萄酒醇类总量均显著提高（0.23～1.36倍），其中效果明显为甘20，其次为G20、甘10，最低为甘30。其中，对照组C中异戊醇（醇香，涩味）的含量损失明显，在126 d仅为8.17 μg/L，甘露聚糖和GSH很好的保护了异戊醇，提高了1.35～3.24倍，以甘20最为明显。其次，不同抗氧化剂提高了瓶装酒的1-己醇（草香）和苯乙醇（花香）的含量，最高为1.6～3.6倍，赋予了酒体更好的花草香。而经抗氧化剂处理的异丁醇在含量上的变化均不显著。
2.3.3 酸类物质及其他
除G30外，5种不同添加量的甘露聚糖和GSH处理的葡萄酒酸类总量均显著低于对照C。与对照C相比，己酸（奶酪，腐败味）、辛酸（奶酪，涩味，腐败味）和正葵酸（脂肪味）下降最明显为G20，分别下降了59%、70.07%和91.24%，其次为甘20为55.41%、48.62%和91.46%，其气味活度值（OAV）＞1，可以显著的降低酒体的酸败味。但不同添加量的抗氧化剂对醋酸的抑制效果不显著。此外，处理酒样的2,5-二甲基苯甲醛（杏仁味）和2,4-二叔丁基苯酚（石碳酸味）的化合物含量均低于对照组（3.912 μg/L和7.804 μg/L），它们含量的升高代表酒体的氧化程度，表明甘露聚糖和GSH延缓了瓶装酒的氧化。
2.4 不同抗氧化剂对白葡萄酒感官评定的影响
对不同抗氧化剂处理的白葡萄酒进行感官评定，结果见表3。由表3可知，在外观方面，甘10、甘20、G20和G30均高于对照组C，其中外观评分最高的为甘20，G10处理的外观评分最低；与对照组C相比，不同添加量的GSH在口感、香气方面的得分均升高，而甘20在口感和香气方面的评分最高为33分和24分。
表3 葡萄酒感官评分
Table 3 Sensory evaluation scores of wines
放置6个月后的葡萄酒整体评价均有所降低，其中空白处理酒样得分为61分，而甘20达到了较好水准（81分），外观、口感、香气都到达最高评分，表明甘20对葡萄酒的品质具有很好的保护作用。
3 结论
谷胱甘肽及甘露聚糖作为瓶装白葡萄酒的抗氧化剂，在储存期间可以保护葡萄酒的色泽，提升了白葡萄酒的亮度L*值、减少了酒体绿色调a*值、黄色调b*值和饱和度，有效降低葡萄酒存放期间的色差值，其中添加20 mg/L甘露聚糖在各项色泽数据分析中表现最佳。不同添加量的抗氧化剂均可以有效延缓葡萄酒中部分酚类物质的降解，尤其是儿茶素和表儿茶素。同时添加20 mg/L甘露聚糖显著提高了酒体没食子酸的含量，高于对照组56.91%。但总酚的含量呈递减趋势，表明甘露聚糖和GSH可能对部分酚类物质存在保护作用。就葡萄酒的香气而言，抗氧化剂的添加显著减缓了辛酸乙酯和乙酸异戊酯等酯类物质的分解，提高了2.97～5.77倍，很好地保留了干白葡萄酒原有的果香味；减缓异戊醇分解，提高1-己醇和苯乙醇的含量，最高为1.6～3.6倍，赋予了酒体更好的花草香；显著降低了贮藏后期辛酸，葵酸、2,5-二甲基苯甲醛和2,4-二叔丁基苯酚的化合物的积累，从而降低了葡萄酒的奶酪腐败味和酸涩味。通过感官评定，20 mg/L的甘露聚糖处理的葡萄酒在外观，口感和香气方面均获得较高的分数，且总分最高为81分。总体来看，添加20 mg/L甘露聚糖对延缓储存期间瓶装白葡萄酒的氧化具有较好的效果。
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