骏枣（Ziziphus jujuba Mill.）是我国红枣主栽品种之一，广泛种植于我国新疆、山西等地。研究表明，骏枣富含氨基酸、维生素、矿物质、多酚、多糖等营养成分[1-3]，具有极高的营养价值和药用价值，有大量文献报道其具有抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等功效[4-6]。
现阶段红枣的精深加工产品主要有红枣汁、红枣干、红枣片、红枣酒、红枣醋等[7]，骏枣作为新疆产量最大的红枣，以鲜食和枣干消费为主，大规模的精深加工利用较为缺乏，研究表明，骏枣干的糖含量为60%～80%，复水打浆后非常适合果酒果醋的酿造[8-9]，对丰富骏枣精深加工产品类型，实现综合加工利用具有重要的意义。目前关于枣醋的加工研究已有报道，但主要集中在不同品种红枣的醋酸发酵工艺优化研究，如王大红等[10]优化了板栗红枣果醋醋酸发酵工艺条件的优化，并测定了果醋的相关品质指标，化志秀等[11]对比研究了初始枣汁、枣酒醪、枣醋的主要营养成分的含量及抗氧化活性，但对探讨枣醋发酵过程中品质变化及发酵前后风味成分分析的研究鲜有报道。
本研究将以骏枣原酒为主要原料，利用前期实验室已优化的醋酸发酵阶段工艺条件，重点研究骏枣果醋发酵过程中酒精度、pH值、可滴定酸、有机酸、总多酚、维生素C、抗氧化能力变化，并对比分析发酵前后挥发性风味成分差异，以期为骏枣果醋的深加工及其产业化提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
骏枣果酒（酒精度12%vol）：实验室制备；醋酸杆菌（Acetobacter aceti）As1.41：实验室保藏；Folin-Ciocalteu试剂：上海源叶生物科技有限公司；磷酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乳酸、草酸、抗坏血酸、苹果酸、柠檬酸、醋酸、琥珀酸（标准品）：美国Sigma-Aldrich公司；焦性没食子酸、葡萄糖、酵母粉、碳酸钙、无水乙醇等其他试剂（均为分析纯）：国药集团化学试剂公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
ALC-210.4分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；UV1800型紫外可见分光光度计、LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；PB-10型pH计：德国Sartorius公司；Infinite M200 Pro酶标仪：瑞士TECAN公司、JW-1042低速离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器、SPX-250B-Z 型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；6980N/5975B气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国Agilent 公司；手动固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）进样器及萃取纤维头50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
骏枣果酒酒精度调整→醋酸菌活化→醋酸发酵→骏枣果醋
操作要点：
（1）酒精度调整：在骏枣果酒中添加无菌水将酒精度调整至6%vol，待醋酸发酵备用。
（2）醋酸菌活化：取适量保藏的醋酸菌种加入已灭菌的醋酸菌液体培养基中（葡萄糖1%，酵母提取粉1%，CaCO3 1%，无水乙醇3%），30 ℃摇床中140 r/min活化培养48 h。
（3）接种发酵：按照10%（V/V）的比例，将活化后的醋酸菌菌液接种至酒精度调整后的骏枣果酒中，通过摇床培养发酵，保持通风，摇床温度控制在28～30 ℃、140 r/min发酵3～4 d。
（4）取样：发酵过程中每隔12 h取样，取样前充分搅拌均匀，分装，冷冻储藏备用。
1.3.2 分析检测
酒精度测定：采用酒精计测定；可滴定酸含量测定：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；总酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu法[12]；总抗氧化能力（T-AOC）测定：按照总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒进行；DPPH自由基清除能力测定：按照文献[13]进行；抗坏血酸及有机酸含量测定：按照文献[14]采用HPLC法测定；挥发性成分测定：按照文献[15]采用SPME-GC-MS法。
1.3.3 数据处理
使用Excel软件进行数据处理和统计分析、SPSS 17.0软件进行方差分析，使用Origin 2018软件绘图。
2 结果与分析
2.1 骏枣果醋发酵过程中酒精度的变化
由图1可知，醋酸发酵0～36 h期间，酒精度由6%vol下降至5%vol，应该是由于发酵液中初始酒精度对醋酸菌的生长有一定抑制作用，醋酸菌的增殖速度较为缓慢，使得酒精的降解量较小；在发酵36～72 h期间，酒精度则迅速从5%vol下降至1.5%vol，说明在此阶段醋酸菌进入快速繁殖期，酒精的降解速度快速增加，因此可以认为这一阶段应为发酵产酸的主要时期；在最后72～96 h期间，随着酒精不断耗尽，醋酸发酵接近结束。
图1 骏枣果醋发酵过程中酒精度的变化
Fig.1 Changes in alcohol content of jujube vinegar during the fermentation process
不同时间点差异显著性以不同字母表示（P＜0.05）。下同。
2.2 骏枣果醋发酵过程中pH值、可滴定酸的变化
由图2可知，由于发酵过程中醋酸、乳酸等多种有机酸的生成，使得pH值不断降低、可滴定酸含量不断升高，两者变化趋势呈负相关趋势。在发酵0～72 h期间，pH值不断降低；发酵72～96 h期间下降速度趋于平缓。可滴定酸含量不断升高，在发酵0～36 h期间，可滴定酸缓慢升高，由2.68 g/L升高至7.80 g/L；在发酵36～72 h期间，可滴定酸快速升高，含量由7.80 g/L升高至23.10 g/L；变化趋势与图1中酒精度的变化情况基本接近，说明骏枣果醋在发酵期间主要发酵阶段为第36～72 h。
图2 骏枣果醋发酵过程中pH值和可滴定酸的变化
Fig.2 Changes in pH and titratable acid contents of jujube vinegar during the fermentation process
2.3 骏枣果醋发酵过程有机酸含量和酸味强度的变化
从表1可以看出，骏枣果酒中乳酸含量最高，达到2 335.47 mg/L，其次是醋酸和柠檬酸，是由于在酒精发酵中，通常伴随着苹果酸-酒精发酵[16]，乳酸菌能将苹果酸转化成乳酸和CO2，使得果酒发酵过程中乳酸大量累积，而醋酸则是酿酒酵母在厌氧条件下发酵过程中产生的主要副产物之一[17]。
骏枣果醋中主要有机酸有醋酸、乳酸和柠檬酸，且醋酸、草酸、乳酸和琥珀酸在发酵前后有显著性变化（P＜0.05），其中果醋中醋酸含量最高，发酵过程中含量显著性升高，由1 951.25 mg/L升高至29 260.29 mg/L，升高接近15倍；乳酸含量仅次于醋酸，在发酵过程中呈先下降后升高的趋势，在发酵36 h时含量达到最低；琥珀酸含量在0～36 h期间显著性增加，随后发酵36～96 h期间含量趋于稳定且变化不显著（P＞0.05），且琥珀酸是酵母菌发酵的主要产物，由于骏枣果酒原料未经热杀菌处理，因此在醋酸发酵前期可能还存在酵母菌发酵，使得发酵前期琥珀酸含量显著上升，后期随着醋酸含量不断增加，pH值不断降低，抑制了酵母菌的生长，使得琥珀酸含量在发酵中后期趋于稳定[18]。另外，柠檬酸与苹果酸在发酵过程中含量均有减少，但变化不显著（P＞0.05），可能由于苹果酸在醋酸发酵过程中被醋酸菌少量利用或被降解；6种有机酸中草酸含量最低，在发酵前期较为稳定，中后期含量显著性降低，可能是因为被醋酸菌代谢利用或者在发酵的强氧化条件下被氧化降解引起[19]。
表1 骏枣果醋发酵过程中各种有机酸含量的变化
Table 1 Changes in organic acid content of jujube vinegar during the fermentation process
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
参考各有机酸的味觉阈值[20]，测算出骏枣果醋发酵过程中各种有机酸的酸味强度，结果如表2所示。由表2可知，发酵过程中醋酸和琥珀酸的酸味强度逐渐增强，骏枣果酒中总酸味强度较低为439.73，其中醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸四种有机酸分别对总酸味强度的贡献为36.90%、29.50%、22.01%、9.02%，合计为97.75%，该四种酸为骏枣果酒的主体酸味来源；经过醋酸发酵后骏枣果醋的总酸味强度是骏枣果酒的6.17倍，而发酵后果醋中总有机酸仅为果酒的4.6倍，骏枣果醋中各种有机酸酸味强度大小依次为醋酸＞乳酸＞柠檬酸＞琥珀酸＞苹果酸＞草酸，其中醋酸对总酸味强度的贡献为89.93%，其他种类有机酸仅为10.07%，表明通过醋酸发酵后，醋酸是果醋酸味表现的主体酸，其他有机酸则为骏枣果醋的辅助酸味特征成分，是骏枣果醋具有一定果酸味的基础。
表2 骏枣果醋发酵过程中酸味强度的变化
Table 2 Changes in acidity intensity of jujube vinegar during the fermentation process
注：味觉强度=有机酸浓度/有机酸味觉阈值。
2.4 骏枣果醋发酵过程中维生素C和总酚含量的变化
由图3可以看出，发酵过程中总酚含量不断下降，由1.14 mg/mL下降至0.59 mg/mL，其在发酵0～48 h期间下降速度较快，发酵48～96 h期间下降速度趋于平稳，总体下降近48%，与朱伟林等[21]在对比研究龙眼醋发酵过程中总酚含量变化趋势一致，李腾宇[22]研究发现红糖醋发酵过程中总多酚含量是逐渐减少的。维生素C含量在发酵0～36 h期间由17.87 mg/mL快速下降至14.41 mg/mL，下降近20%，后期则总体趋于稳定。化志秀等[11，23]发现在液态深层发酵法发酵枣醋阶段维生素C含量呈下降趋势，出现这种现象可能是由于醋酸发酵为好氧发酵，属于氧化过程，长时间的氧化反应导致维生素C和酚类物质发生降解[24]，从而使维生素C和总酚含量渐渐降低。
图3 骏枣果醋发酵过程中维生素C和总酚含量的变化
Fig.3 Changes in vitamin C contents and total phenols contents of jujube vinegar during the fermentation process
2.5 骏枣果醋发酵过程中抗氧化能力的变化
由图4可知，DPPH自由基清除能力在发酵0～36 h期间下降，之后显著升高，在发酵96 h后骏枣果醋的DPPH自由基清除率达到89.75%，相比发酵前骏枣果酒的DPPH自由基清除率升高7.22%，总抗氧化能力在发酵过程中同样显著性升高，在发酵96 h后骏枣果醋的总抗氧化能力达到0.74 mmol/L，相比发酵前骏枣果酒的总抗氧化能力提高2.9倍，与抗氧化成分总多酚和维生素C的变化趋势相反，说明果醋发酵过程中DPPH自由基清除率与抗氧化成分的含量变化不成正相关。同样的，杨玉霞[25]的研究也发现百香果醋的DPPH自由基清除能力显著优于百香果酒，高出将近32%，化志秀等[11]的研究同样发现红枣醋发酵阶段维生素C含量下降、总抗氧化力呈极显著上升趋势，CHEN Y等[26]研究柑橘醋发酵过程中总黄酮含量下降6.4%、总多酚含量升高5.7%，但抗氧化活性升高46.7%，出现这种现象可能是由于醋酸发酵过程中产生了某些代谢产物，有利于清除DPPH自由基，也有可能是由于果醋发酵过程中醋酸含量大幅上升，酸度的不断升高提供了更多带正电的氢离子，进而提高了自由基的清除率[27]。
图4 骏枣果醋发酵过程抗氧化能力的变化
Fig.4 Changes in total antioxidant capacities of jujube vinegar during the fermentation process
2.6 骏枣果醋发酵前后风味成分的变化
表3 骏枣果酒和果醋中香气物质种类及相对含量
Table 3 Aroma components and relative contents of jujube wine and jujube vinegar
续表
注：“/”表示未检出。
由表3可知，从骏枣果酒和果醋中共检测到65种香气物质，其中骏枣果酒中有47种，主要分为酯类（23种）、烃类（7种）、醛类（9种）、醇类（3种）、酮类（2种）、醚类（1种）、酚类（1种）和其他物质（1种）等8大类挥发性化合物。骏枣果醋中检测到39种香气物质，主要分为酯类（18种）、酸类（3种）、烃类（3种）、醛类（4种）、醇类（7种）、酮类（1种）、酚类（1种）和其他物质（2种）等8大类挥发性化合物。对比发酵前后，红枣酒和红枣醋共有香气物质21种，红枣醋中烃类化合物减少了4种、酯类和醛类化合物分别减少了5种，增加了乙酸、庚酸、癸酸3种酸类化合物和4种醇类化合物。应该是由于发酵过程中酯类物质发生分解，醛类、酮类等物质进一步还原成酸，使得发酵后酯类化合物种类减少、酸类化合物种类增加。
骏枣果酒中酯类挥发性化合物相对含量最高为44.75%，其中甲酸异戊酯相对含量最高为20.71%、乙酸乙酯相对含量为7.97%、丁二酸二乙酯相对含量为4.20%，骏枣果醋中酯类挥发性化合物相对含量最高为37.27%，其中乙酸乙酯相对含量最高为22.62%、乙酸异戊酯相对含量为9.17%，对比发酵前后，酯类化合物中乙酸乙酯升高14.76%、乙酸异戊酯升高7.25%、甲酸异戊酯降低20.37%，果醋的发酵风味物质是主要由乙酸乙酯或甲酸乙酯引起，发酵风味强多是由于这些物质的含量过高。
发酵后骏枣果醋中新增酸类挥发性化合物，相对含量为30.72%，仅次于酯类化合物，其中乙酸相对含量最高为30.55%，另外两种挥发酸相对含量较低，庚酸为0.08%、癸酸为0.09%，构成了果醋主要的挥发性风味成分，具有显著的呈味作用，可修饰其他滋味，起到一定的改善调和风味的效果。另外，红枣醋中醛类物质相对含量仅为1.26%，相比红枣酒（9.27%）大幅下降，由于部分醛类物质具有类似苦杏仁、辛辣刺激的不良风味[28]，因此通过醋酸发酵能够有助于提高骏枣果醋的整体风味效果。
3 结论
通过分析骏枣果醋发酵过程中酒精度、pH值、可滴定酸、有机酸、维生素C、总酚含量及抗氧化活性等品质指标变化情况，及发酵前后挥发性成分的差异，发现在发酵36～72 h期间，酒精度快速从5%vol下降至1.5%vol，可滴定酸快速积累，由7.8 g/L升高至23.1 g/L，该阶段为发酵产酸的主要时期；检测到发酵过程中主要有醋酸、草酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸共6种有机酸，其中醋酸含量最高，其次是乳酸，醋酸和琥珀酸在发酵过程中含量显著性升高，乳酸和草酸含量显著性降低，柠檬酸和苹果酸含量整体变化较为稳定。发酵过程中总酚含量不断下降，维生素C含量则在0～36 h期间下降近20%后趋于稳定，发酵过程中总抗氧化能力一直呈显著性升高趋势，DPPH自由基清除能力先稍微下降后显著性升高。GC-MS分析结果表明，发酵后骏枣果醋中检测到香气物质共39种，相比发酵前骏枣果酒减少醚类挥发性化合物，但增加了3种酸类挥发性化合物。后续将重点研究骏枣果醋的澄清及乳酸分离工艺，并评价骏枣果醋贮存期品质及风味的变化，以期为开发优质骏枣果醋新产品，实现产业化生产提供更为充分的参考依据。
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