红曲霉作为传统食品加工的特殊微生物，主要用于生产红曲[1]。红曲是以大米为主要原料，经红曲霉固态发酵而制成的一种米曲，红曲米含有抗氧化和抗肿瘤等活性成分[2]。红曲霉耐高温，生长温度范围在15～45 ℃，最适生长温度为25～30 ℃，最适生长pH值为3.5～5，耐pH最低为2.5，嗜乳酸，耐乙醇浓度为10%vol[3]。多数红曲霉能代谢产生红曲色素，产生的色素进入培养基中，进而使培养基的背面呈现出不同的颜色[4]。红曲霉生长过程中能产生多种酶类（如淀粉酶、糖化酶、酯化酶等），用于制备红曲米醋或红曲麸曲；有些菌株还能代谢产生较高活性的蛋白酶，用于腌制“色、香、味”俱佳的红曲腌渍鱼、肉或豆腐等高蛋白食品[5-6]。
白酒酿造中的酯化菌主要包括霉菌和酵母菌等，其主要来源于酿酒大曲，市售的商品酯化红曲复合酯化酶生态菌剂主要用于提高原酒的出酒率和优质率等，生产应用效果明显[7-8]。
为研究分离筛选自企业的红曲霉菌株的制曲生产特性，优化该菌株酯化红曲的制备工艺，以制备适合白酒酿造的酯化红曲，本研究通过对红曲霉菌株ZHX9进行液体培养，再分别以大米、麸皮及混合料等为原料进行纯种培养，选取种子液添加量、培养温度、培养时间和曲料含水率等作为影响因素，以强化制曲的酯化力为考察指标，优化酯化红曲的制备工艺，该研究可为红曲霉菌株ZHX9的制曲生产应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
制曲原料（麸皮、大米、稻壳等）：金种子酒业制曲车间；红曲霉（Monascus purpureus）ZHX9：金种子酒业微生物实验室；葡萄糖、NaNO3、MgSO4·7H2O、乳酸等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
种子液培养基：葡萄糖70 g，牛肉膏15 g，NaNO3 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1.5 g，水1 000 mL，pH自然。斜面培养基：种子液培养基加琼脂15～20 g。米曲培养基：大米浸泡1～2 h后沥水，常压蒸40～60 min左右至米饭蒸透而不粘手，摊晾冷却至35 ℃左右。麸曲培养基：麸皮添加适量的清水，并翻拌均匀后沥干无明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，摊晾冷却至35 ℃左右。混合料培养基：麸皮∶米粉∶干燥曲酒糟（96∶3∶1，g∶g）添加适量的清水，翻拌均匀后沥干无明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，摊晾冷却至35 ℃左右。
1.2 仪器与设备
BXM-100VD立式压力蒸汽灭菌器、BJ-2CD净化工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HYG-W1恒温摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司；LHS-800HC-II恒温恒湿培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；7890B气相色谱仪：美国安捷伦公司；麸曲培曲框：本实验室自制。
1.3 实验方法
1.3.1 红曲霉菌株的的活化及其种子液培养
将红曲霉菌株ZHX9转接于斜面培养基上，30 ℃培养3～5 d活化，取0.5 cm2左右的菌块接种到种子液培养基中，30 ℃、160 r/min恒温摇床培养3～5 d，菌丝球生长均匀浓密，可在种子培养基中添加数颗玻璃珠以防止菌丝球过于集中生长。
1.3.2 强化制曲
摊晾冷却后的米饭喷洒乳酸稀释液，并接种10%左右的种子液，翻拌均匀后置于培养框内；培养框的下层及米料的表层均铺设有2层已灭菌的医用纱布，米料厚度在5～10 cm，置于恒温恒湿培养箱内进行培曲，培养箱湿度100%，30 ℃间歇通风培养。以成品米曲的酯化力为评价指标，设置单因素试验考察培养时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、培养温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、曲料水分含量（35%、45%、50%、65%、70%）、不同乳酸含量（0、2‰、4‰、6‰、8‰）等条件对强化米曲培养的影响。
1.3.3 菌株ZHX9的强化曲酶活检测
强化曲的糖化力、发酵力等的测定参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》中的方法并略有调整[9]。酯化力的测定，称取相当于5 g干曲的曲量，加入100 mL含1%己酸、20%vol乙醇的酯化体系中，32 ℃酯化100 h，加水50 mL蒸馏，接馏出液100 mL，用气相色谱检测反应体系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定义：100 mL馏出液中含己酸乙酯的毫克数[10]。
2 结果与分析
2.1 菌株ZHX9的活化及其种子液培养
产酯化酶微生物液态发酵代谢产生的酯化酶具有催化发酵体系中有机酸酯的合成等作用，酯化酶催化反应既能利用发酵物料成分进行生化反应进而合成有机酸酯，当合成的有机酸酯达到一定浓度时，酯化酶又能分解产生的有机酸酯；随着发酵体系反应时间的进行，发酵体系中剩余酯最多的时间点或酯化达到平衡的时间即为该产酯化酶微生物发酵的最佳培养时间[11]。红曲霉液态发酵可产生包括红曲色素、酯化酶等在内的多种酶类，以及具有降血脂功效的红曲Monacolin K等特殊活性物质[12]，对液态发酵条件的优化研究有利于实现红曲及其酶类制品的工业化扩大生产[13-16]。由图1可知，活化后的保藏菌株ZHX9状态良好，菌丝初为粉红色，后颜色逐渐加深呈紫红色，其菌落生长致密、可见气生菌丝、培养基呈深紫红色；斜面培养基的背面可见有明显的菌落褶皱；成熟种子液的菌丝球与菌丝体呈混合状态且生长浓密，种子液呈淡黄色，稍黏稠，气味正常，稍有醇香。
图1 红曲霉菌株ZHX9的斜面保藏及其成熟种子液的培养特征
Fig.1 Slope preservation of Monascus strain ZHX9 and culture characteristics of its mature seed solution
a、斜面保藏正面；b、斜面保藏背面；c、成熟种子液。
2.2 菌株ZHX9的米曲培养
由于大米等多孔基质的疏松程度不同，影响了空气等物质的传递，导致菌体生长微环境的差异，因此，固态发酵具有典型的不均一性；其中，培养温度、培养时间、曲料水分含量等对固态发酵红曲米曲的培养质量具有重要影响[17]。
由图2（a）可知，随着培养时间的延长，固态发酵强化米曲的酯化力不断增加；其中，当培养时间达到3 d时，强化米曲的酯化力达到715 mg/100 mL，培养5 d时强化米曲的酯化力变化不明显，因此，确定强化米曲的培养时间为3 d较为适宜。由图2（b）可知，随着培养温度的升高，固态发酵强化米曲的酯化力呈先升高后降低的趋势，培养温度为35 ℃时酯化力最高，之后略有下降。因此确定强化米曲的培养温度为35 ℃较为适宜。曲料水分含量低会影响制曲微生物的生长，水分含量高时曲料容易结团且通气性差，同样不利于制曲微生物的生长，对成品麸曲及麸曲发酵产酒的酸度有不利影响，由图2（c）可知，曲料水分含量在55%左右较为合适。与细菌和放线菌相比，多数霉菌更易在酸性环境下生长，曲料具有一定的酸度还有利于培曲前期杂菌的控制；由于红曲霉具有耐乳酸的特性，因此，通过添加乳酸来调节曲料培养基的pH值，由图2（d）可知，不同乳酸浓度对红曲霉菌固态发酵合成酯化酶具有显著的影响，在乳酸浓度为4‰时较为合适。综合可知，红曲霉菌株ZHX9的强化米曲较适宜的培养条件：培养时间为3 d，培养温度为35 ℃，水分含量为55%，乳酸添加浓度为4‰。
图2 菌株ZHX9强化米曲培养的主要影响因素考察
Fig.2 Main influencing factors on culture of strain ZHX9 cultured by intensified Miqu
a、培养时间；b、培养温度；c、水分含量；d、乳酸浓度。
菌株ZHX9的强化米曲培养过程中的感官变化见图3。由图3可知，大米蒸煮后摊晾降温到35 ℃左右，种子液的接种量为10%左右，喷洒4‰的乳酸并翻拌均匀；温度35 ℃，湿度100%，间歇通风培养24 h，菌丝萌发，呈现乳白色，有的米粒呈现淡红色；再培养48 h，菌丝生长旺盛、菌丝饱满并深入到米粒内部，呈现淡红色，以后逐渐加深，由淡红色为深红色，最后成为紫红色，局部有橙红色或黄色；培养过程中，每天观察米料的品温及干湿情况，及时喷洒无菌水或翻拌米料，翻拌米料时可以闻到有酒香气味。培养3 d的成熟米曲，置于40 ℃通风干燥粉碎后得到的固体曲粉呈深紫红色。
图3 红曲霉菌株ZHX9的强化米曲培养特征
Fig.3 Characteristics of intensified Miqu culture of Monascus strain ZHX9
a、培养初期；b、培养中后期；c、培养成熟并干燥粉碎。
2.3 菌株ZHX9的麸曲培养
麸曲是以麸皮为原料，经蒸煮灭菌、冷却等，接入纯种酿酒微生物，在人工控制条件下经培养、低温烘干而制备的散曲，主要有细菌麸曲、根霉麸曲和酵母麸曲等类型[18]。
曲料的含水量是制备麸曲过程中的重要因素，含水量过低，曲料过快干结，达不到制曲微生物生长需求的湿润环境；含水量过高，会导致曲料结合紧密，曲料的供氧和散热都受到影响，导致曲料温度控制困难，从而影响制曲微生物的代谢产酶，由此可见，曲料的含水量对纯种麸曲质量的影响较为明显[19]。
菌株ZHX9的强化麸曲培养过程中的感官变化见图4。由图4可知，麸皮蒸煮后摊晾降温到35 ℃左右，种子液的接种量为10%左右，喷洒4‰的乳酸并翻拌均匀，曲料含水量在55%左右；温度35 ℃，湿度100%，间歇通风培养24 h，菌丝萌发，呈现乳白色；再培养48 h，菌丝生长旺盛、菌丝饱满并深入到曲料内部，局部呈现淡红色；培养过程中，每天观察曲料的品温及干湿情况，及时喷洒无菌水或翻拌曲料，翻拌曲料时可以闻到有明显曲香。若成品麸曲的含水较高则对麸曲的保存、酿酒发酵条件的控制及产酒质量等产生不利影响；因此，培养成熟的麸曲应通风干燥，通常干燥温度不高于40 ℃以保证酶的活力不受影响。烘干后的成品麸曲呈金黄色，局部呈灰褐色，比麸皮颜色略重，具有明显曲香，无腐臭等异杂味。
图4 菌株ZHX9的强化麸曲培养特征
Fig.4 Characteristics of intensified Fuqu culture of Monascus strain ZHX9
a、培养初期；b、培养中后期；c、培养成熟并干燥粉碎。
2.4 菌株ZHX9的混合曲料培养
混合料培养基采用麸皮、米粉、干燥曲酒糟等，其质量比为96∶3∶1，添加适量的清水，并翻拌均匀后沥干无明水，含水率在50%左右，0.1 MPa带压蒸40～60 min左右；再摊晾冷却至35 ℃左右，添加10%左右的种子液，喷洒4‰的乳酸并翻拌均匀，曲料含水量在55%左右。混合曲料选用干燥曲酒糟等作为培养基辅料，由于干燥曲酒糟具有弹性，可以起到疏松曲料的作用，培曲过程中曲料中含有相当量的空气，有利于红曲霉菌株在有氧的情况下大量繁殖，并避免曲料发粘以及由于透气性差所导致的发酸或发臭等现象，还有利于降低制曲的生产成本。
如图5所示，菌株ZHX9的混合曲料培养过程中，由于干燥曲酒糟的添加增加了曲料的通透性与酸度，有利于红曲霉菌的生长，菌株的萌发时间提前，且菌体的生长较快并深入到曲料内部，局部呈现紫红色。干燥后的成品混合料曲呈浅紫红色，局部呈褐色，具有明显的曲香，无腐臭等异杂味。
图5 红曲霉菌株ZHX9的混合曲料培养特征
Fig.5 Characteristics of enhanced mixed Qu culture of Monascus strain ZHX9
a、培养初期；b、培养中后期；c、培养成熟并干燥粉碎。
2.5 菌株ZHX9各培养料强化曲的酶活检测
由表1可知，利用大米、麸皮或混合曲料制备菌株ZHX9的强化曲，其酯化力、糖化力等指标均比传统酿酒大曲略高，其中米曲酯化力达到745 mg/100 mL，混料曲糖化力达到1 065 mg/（g·h），均表明红曲霉菌株ZHX9具有较高的强化制曲应用前景。混合料制备酯化红曲的指标与采用大米或麸皮等单独作为原料制备的酯化红曲差距并不明显，混合料红曲的糖化力与发酵力略高，混合料还具有生产成本低的特点，因此，采用混合料制备酯化红曲具有明显的优势。
表1 菌株ZHX9的强化曲酶活检测结果
Table 1 Detection results of enzyme activity of intensified Qu of strain ZHX9
有研究表明，酯化红曲通常采用麸皮、大米等作为生产原料，杜礼泉等[20]应用烟灰色红曲霉制备麸曲，发现pH对麸曲的污染控制较为重要，当pH控制在4.3～4.8时可以有效避免麸曲培养过程中的污染问题，酯化率达到35%以上，采用黄水调整曲料的酸度明显优于乳酸。李桂英等[8]采用纯种红曲霉制曲，以大米及麸皮制备种子，应用大米为主料再进行扩大培养，取得较好效果。制曲时对原料的处理、培曲过程中的补水及温度调整、通气控制等都有较高要求。关于利用大米、麸皮和稻壳等作为混合曲料制备菌株ZHX9的强化红曲工艺方面，还应该针对配料比例，曲料的pH、含水量及微量成分添加，培曲条件等方面进行优化分析，以进一步提高成品混料酯化红曲的质量。
3 结论
本研究对企业分离筛选的红曲霉菌ZHX9进行液体培养，再分别以大米、麸皮及混合料等为原料进行纯种培养，其中混合料明显优于大米或麸皮等单独作为原料制备酯化红曲，在培养温度35 ℃、培养时间3 d、曲料含水率55%、乳酸添加量4‰条件下，混合料成品酯化红曲的酯化力为716 mg/100 mL、糖化力为1 065 mg/（g·h）、发酵力为2.01 g/（0.5 g·72 h），表明该菌株的酯化红曲具有较高的应用价值。混合料采用麸皮、米粉、稻壳等为原料，各原料的添加比例以及混料曲培养过程中的条件控制等，还需要进一步优化分析，以提高成品混料酯化红曲的质量。酯化红曲传统固体发酵中的有关机理及其制曲工艺、主要酯化酶的作用特性等还需要进一步研究。
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