番茄红素是一种能够中和多种氧化因子[1-2]的天然类胡萝卜素[3]。研究发现番茄红素对多种癌细胞[4-6]有抑制作用，并能防止人体胞内基因突变[7]。这些特性使番茄红素在保健食品领域有很广阔的市场。
番茄红素的3种来源为直接提取[8]、化学合成[9]和微生物发酵[10]。粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）作为一种常见真菌，其具有较高的产番茄红素能力[11-12]，且不像三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）需要接种正负菌[13]，操作简便，有作为工业发酵菌种的潜力。培养基成分对微生物发酵有很大影响，微生物生长情况及发酵产物的产量因为其组成成分的不同而变化。碳源、氮源、金属离子等都对微生物发酵有影响[14-15]，而氮源的选择与添加时间均对微生物发酵有明显的影响。研究发现，单独的氨基酸添加、植物性氮源代替动物性氮源等对氮源的改变都能够不同程度的提高微生物次级产物的产量。三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）菌培养过程中，加入一定量氨基酸可以显著增加番茄红素产量[16]；王蓉等[17]研究发现不同的无机氮源可提高黏性红酵母产番茄红素产量；植物性氮源对肺炎双球菌[18]、乳酸菌[19]的生长均有促进作用且植物蛋白相较于动物蛋白对某些微生物有更好的生长促进作用；分别对柠檬酸、ε-聚赖氨酸[20-21]发酵生产过程的研究证实，在发酵过程中添加相应氮源能有效提高产量。本研究研究了大豆蛋白胨在粗糙脉孢菌发酵产番茄红素过程中的影响，并对其发酵工艺进行优化，为粗糙脉孢菌发酵高产番茄红素的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）3.1607，在-20 ℃下保藏于实验室冰柜，采购于广东微生物菌种保藏中心。
1.1.2 试剂
谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸（均为分析纯）、乙酸乙酯、丙酮色、乙腈、二氯甲烷（均为色谱纯）：西陇科学股份有限公司；番茄红素标准品（纯度≥98%）：上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
种子培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：马铃薯浸出粉12 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂14 g/L，pH 5.6。
基础发酵培养基：葡萄糖18 g/L，蛋白胨12 g/L，NaNO3 1.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.24 g/L，KCl 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.006 g/L，K2HPO4 0.6 g/L，加蒸馏水制成1 L培养液，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
TS-1210B型恒温摇床：苏州市国飞实验室仪器有限公司；SW-CJ-1B标准净化工作台：苏州净化仪器厂；LC-100型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Agilent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌体悬液制备
将100 mL蒸馏水的锥形瓶灭菌后接入30 ℃马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化的孢子，制成6×105 CFU/mL的孢子悬液，置于无菌操作台中备用。
1.3.2 摇瓶培养[22]
将50 mL培养基置于锥形瓶，接入菌悬液，移入摇床培养箱中100 r/min培育19 h，后静置培养87 h，共培养106 h，全程光照，温度恒定在30 ℃，每次进行3组平行实验，所有试验均以该条件培养。
1.3.3 生物量测定
将菌体从锥形瓶中取出，蒸馏水冲洗后抽滤，获得的菌体于烘箱中50 ℃下烘干48 h至质量恒定，使用分析天平称量。
1.3.4 番茄红素的测定
番茄红素提取[23]：细磨加入了石英砂的干燥菌体，置入10 mL乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V），于200 W，40 kz，30 ℃超声处理20 min后在33 ℃水浴锅中暗室浸提2.5 h。上层清液以6 000 r/min离心10 min，经过0.22 μm滤膜去除杂质即可，每组制备3个平行组，进行HPLC检测。
HPLC色谱检测条件[24]：色谱柱为Agilent Ecllpse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流动相采用乙腈-二氯甲烷（3∶2，V/V），检测波长472 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。
制作番茄红素标准曲线[25]：以乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V）为溶剂，称取番茄红素标品制备质量浓度为100 μg/mL的溶液。稀释溶液为0、10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、90 μg/mL、100 μg/mL的标准溶液。以色谱条件作定性分析，得到各个梯度的吸收峰面积，以质量浓度为纵坐标（Y），峰面积为横坐标（X）进行标准曲线线性回归计算，得到番茄红素标准品回归方程：Y=24.933X+10.719（R2=0.9987）。
1.3.5 单因素试验设计
大豆蛋白胨添加量：在加入大豆蛋白胨、添加时间为53 h、接种量6%的条件下，探究添加量分别为0、2 g/L、6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L时对番茄红素产量的影响。
大豆蛋白胨添加时间：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接种量为6%的条件下，探究大豆蛋白胨添加时间分别为11 h、25 h、39 h、53 h、67 h对番茄红素产量的影响。
菌种接种量：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接种时间为6%的条件下，探究接入2%、3%、4%、5%、6%、7%的菌种时对番茄红素产量的影响。
1.3.6 响应面试验
在单因素试验的基础上，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加时间（B）、接种量（C）为自变量，番茄红素产量（D）为响应指标进行响应面试验（response surface methodology，RSM）设计，RSM因素与水平见表1。
表1 蛋白胨添加条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for peptone addition conditions optimization
1.3.7 数据分析
Design Expert 8.0.6软件分析数据，所得结果均为3次平行测定均值，Origin 8.5制作单因素试验图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 大豆蛋白胨添加量优化
图1 大豆蛋白胨添加量对粗糙脉孢菌产番茄红素的影响
Fig.1 Effect of soybean peptone addition on lycopene yield by Neurospora crasa
由图1可知，添加了大豆蛋白胨后，粗糙脉孢菌的干质量和番茄红素产量都有一个明显的提高。干质量随着添加量的增加而增加，说明大豆蛋白胨促进了菌体的发育。当添加量达到6 g/L时菌体干质量增加明显放缓，可能是因为此时菌体密度过于稠密，限制了菌体的继续发育，从而导致干质量增长放缓。番茄红素产量随大豆蛋白胨的量增加而获得提升，为10 g/L时达到顶峰；在大豆蛋白胨＞10 g/L时产量降低，产量随大豆蛋白胨的增加而减少，一方面可能是因为孢子生长减缓，扩增受到限制，另一方面可能是因为大豆蛋白胨过量，分解的肽段过多促进了菌体菌丝的生长，造成了光的诱导作用减弱，造成了产量下降。故蛋白胨最佳添加量为10 g/L。
2.1.2 大豆蛋白胨添加时间优化
图2 大豆蛋白胨添加时间对粗糙脉孢菌产番茄红素的影响
Fig.2 Effect of soybean peptone addition time on lycopene yield by Neurospora crasa
由图2可知，在39 h之前，粗糙脉孢菌干质量随大豆蛋白胨添加时间的增加而相应提高，当到达39 h时干质量达到顶峰，之后干质量随着添加时间的增加而减少。这可能是因为培养的11～53 h期间是粗糙脉孢菌的对数生长期，此时加入大豆蛋白胨主要为粗糙脉孢菌补充菌体生长发育所需的肽段[26]，促进粗糙脉孢菌的快速增殖，增加干质量。在53 h之前，番茄红素的产量随着添加时间的增加而相应提高。添加时间为53 h时，番茄红素产量达到峰值，之后产量下降。可能因为53 h左右时菌体开始进入稳定期，此时次级产物开始大量合成，这时加入的大豆蛋白胨主要为菌体提供了必要的氨基酸等合成次级产物的基础物质，促进了次级代谢产物番茄红素的合成，因此产量也增加。在53 h之后加入大豆蛋白胨，因为已有番茄红素的影响同时有的番茄红素开始合成β-胡萝卜素这一下级产物，添加后番茄红素前体的增多相应促进了下一级产物的合成，因此产量减少。故大豆蛋白胨的最佳添加时间为53 h。
2.1.3 菌种接种量优化
由图3可知，粗糙脉孢菌的干质量随着接种量的增大而先升高后降低。接种量5%时，干质量达到峰值，可以看出菌体干质量受到的影响有限，可能是因为所用锥心瓶容积有限，生长时菌体受空间限制无法更多生长。接种量＜6%时产量随接种量增加而提高，之后下降，可能因为接种量＞6%时，菌丝生长过于茂盛，使培养液的浑浊度过高，影响了光照对菌体番茄红素的诱导作用最终导致产量的下降。故最佳接种量为6%。
图3 接种量对粗糙脉孢菌产番茄红素的影响
Fig.3 Effect of inoculum on lycopene yield by Neurospora crasa
2.2 响应面法优化大豆蛋白胨添加条件
2.2.1 响应面试验结果与分析
根据2.1中所得试验结果，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加时间（B）和菌种接种量（C）作为自变量，番茄红素产量（D）作为响应值进行响应面试验设计。响应面试验设计及结果见表2。
表2 大豆蛋白胨添加条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface methodology for soybean peptone addition conditions optimization
2.2.2 模型建立与方差分析
对表2的试验结果进行处理分析，最后得到了响应值番茄红素产量（D）对编码自变量A、B、C的方程预测模型为：
方差分析结果见表3。结果中的F值大小及P值大小表示表2结果数据是否显著。一般来说，F值越大，对应数据越显著；P值越小，对应数据越显著。如表3所示，模型的F值为141.50（P＜0.0001），具有非常高的显著性，同时可以看到，失拟项的F值为1.84（P＞0.05）表现为不显著，说明模型不能使用的可能性低，模型良好。模型决定系数R2=0.9945，表示模型变化来源于自变量的比例，表明模型响应值的变化99.45%来自所选自变量，另外存在0.55%的总变异无法采用此模型解释，极低的变异比例说明模型能较好的解释结果。校正决定系数R2adj=0.987 5，信噪比=34.02＞4，说明模型拟合度良好。其中因素A和B、二次项A2、B2对产量影响极显著（P＜0.01），交互项AB对产量影响显著（P＜0.05）。由系数值A=0.64，B=0.26，C=0.059，可知因素的主效应关系为：大豆蛋白胨添加量＞添加时间＞接种量。
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface methodology results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.2.3 各因素间相互作用
如图4a所示，大豆蛋白胨添加量和添加时间之间对粗糙脉孢菌番茄红素产量影响显著，存在最高点[27]，即大豆蛋白胨添加量在10～12 g/L之间、添加时间在53～60 h之间时，番茄红素的产量达到最高。而观察图4b、4c可以明显发现AC、BC的响应面图不形成闭环，且从表3可以发现，两者P值均＞0.05，其交互作用不显著。依据所得数据，结合已计算出的实验方程，分析获得的最佳发酵条件如下：大豆蛋白胨添加量10.80 g/L，添加时间55.27 h，接种量6.17%，添加后培养50.73 h，预测番茄红素产量达到最大值9.65 mg/L。
图4 各因素交互作用对番茄红素产量影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on lycopene yield
2.2.4 验证试验
为了便于实际操作，将理论最佳发酵条件修正为：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加时间55 h，接种量为6%，添加蛋白胨后继续培养51 h。经过3次重复试验检验，获得的番茄红素产量实际值为（9.64±0.15）mg/L，此结果与预测值基本吻合，没有明显差异。
3 结论
本实验研究了大豆蛋白胨对粗糙脉孢菌产番茄红素的影响，确定了大豆蛋白胨对粗糙脉孢菌产番茄红素有明显影响。结合单因素与响应面法优化了大豆蛋白胨添加量、添加时间及菌种接种量因素，影响因素顺序依次为：大豆蛋白胨添加量＞添加时间＞接种量。最佳发酵工艺条件为：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加时间55 h，接种量6%，添加蛋白胨后继续培养51 h。此优化条件下，番茄红素的产量为9.64 mg/L。
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