蓝莓（Vaccinium citisidaea）为杜鹃花科越橘属，表皮外披白霜，果肉酸甜可口，风味独特；因富含各种营养成分被誉为——“浆果之王”[1]，其果实中的营养成分主要有花青素（其花青素含量是所有水果中最高的[2]）、类黄酮、超氧化物歧化酶等化合物。这些丰富的营养成分使其具有很好的保健功能，还因此被联合国粮农组织列为世界五大健康食品之一[3-7]。由于蓝莓果实柔软多汁，易破碎、腐烂，导致其保鲜难度和保鲜成本较高，因此提倡以加工为主对其进行综合利用。果酒是以水果为原料，酿造得到的低度酒精饮料；除含有乙醇外，还富含机体所需多种微量营养素、糖、有机酸等物质，因而具有一定的保健功能[8]。蓝莓酒作为蓝莓的一种加工产品，既在一定程度上保留了蓝莓的营养、风味，又融合了果酒的营养保健功效，符合现在社会人们的饮食生活习惯及对健康生活的追求。
蓝莓酒的风味主要依赖于酒中所含的糖、单宁和酸类物质[9]，蓝莓本身的风味及其在发酵过程中所呈现的独特的香气成分也是蓝莓酒风味物质的重要组成部分。风味物质的种类、浓度及其融合度直接决定了蓝莓酒口感的协调性、复杂性和典型性[10]。此外，不同酵母菌株的最适条件、发酵性能的差异对蓝莓酒的风味物质也有影响。因此，本实验采用气相色谱法和液相色谱法对不同酵母菌株发酵的蓝莓酒的风味物质进行探究[11-13]，并以电子舌对蓝莓酒进行感官分析[14-16]，为蓝莓酒的研究及开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生蓝莓鲜果（鲜果总糖12.46%，总酸2.37 g/kg）：内蒙古根河野生资源开发公司；产酯酵母菌T1、耐酸酵母菌FK3-2、耐糖酵母菌LM6：本实验室筛选保藏；偏重亚硫酸：天津化学试剂三厂；白酒混合标样-15组分（色谱纯）：兰州东立龙信息技术有限公司；甲醇（分析纯）：天津市鼎盛鑫化工有限公司。
1.2 仪器与设备
美嘉宝A-103多功能榨汁搅拌机：购于华联超市；FA2104N电子分析天平：奥豪斯仪器上海有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PAL-1糖度仪：日本TOKOY ATAGO公司；GC-7900气相色谱（gas chromatography，GC）分析仪：上海天美科学仪器有限公司；G7129A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析仪：新加坡安捷伦科技；SA402B电子舌：北京盈盛恒泰科技有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 蓝莓酒发酵及检测
将酵母菌分别接种于灭菌的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基中进行活化。将活化的T1、FK3-2和LM6菌液以3%接种量接种于蓝莓与水1∶1的蓝莓汁中，添加偏重亚硫酸钾240 mg/L、白砂糖（使初始糖度达到32.2°Bx）等进行成分调整，并将蓝莓醪液的pH调至3.8。在28 ℃培养箱中恒温发酵，分别在主发酵7 d、14 d、21 d及28 d取样进行气相色谱、液相色谱及电子舌检测。为保持成品酒口感，至残糖8.0°Bx后终止发酵，将蓝莓酒过滤除菌，于14 ℃培养箱中静置。
1.3.2 样品的制备
气相色谱标样的配制：标样为白酒混合标样15组分，包括乙醛、甲醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、异丁醇、乙缩醛、正丁醇、异戊醇、丁酸乙酯、乙酸正丁酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、正己醇；内标物：乙酸正丁酯（0.173 4 mg/mL）。
液相色谱标准溶液的配制：分别配制质量浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL的草酸溶液，质量浓度为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL的酒石酸溶液、DL-苹果酸溶液、α-酮戊二酸溶液、乳酸溶液、冰乙酸溶液、柠檬酸溶液、L-焦谷氨酸溶液、琥珀酸溶液，混合标准溶液浓度为2.0 mg/mL，超声波脱气20 min。
气相色谱法检测样品的处理：取样品20 mL蒸馏，蒸馏至馏出液10 mL，将馏出液用0.22 μm级的滤膜过滤，取1 mL过滤后的馏出液与10 μL内标液混匀。
液相色谱法检测样品的处理：称取10 mL蓝莓酒，加适量活性炭后用玻璃棒搅拌1min，搅拌均匀后静置10～20min。将静置后的酒液抽滤，通过0.22 μm的滤头过滤后装入进样瓶备用。
电子舌检测样品的处理：将发酵结束的蓝莓酒使用双层纱布过滤后倒入电子舌检测专用杯，酒液倒至内缘分界线上端1～3 mm处。
1.3.3 色谱条件
气相色谱条件：色谱柱为LZP-930（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；柱温初始温度50 ℃保持6 min，再以8 ℃/min升温至170 ℃，保持8 min；氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）；进样口温度220 ℃；检测器温度230 ℃；载气为氮气；进样量为1 μL。采用内标法定量分析。通过计算待测组分与内标物峰面积的比值，获得待测样品香气成分的含量。
高效液相色谱条件：色谱柱为Poroshell 120 EC-C18（150 mm×4.6 mm，4 μm）；柱温40 ℃；流动相为100%的0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液[17]（磷酸调至pH 2.9）；流速0.30 mL/min；紫外检测波长210 nm；进样量10 μL。
2 结果与分析
2.1 不同酵母发酵蓝莓酒挥发性物质含量比较
对3种酵母发酵蓝莓酒分别在主发酵7 d、14 d、21 d及28 d取样进行15种挥发性物质分析结果见表1～表3。
表1 FK3-2酵母发酵蓝莓酒15种挥发性物质含量测定结果
Table 1 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast FK3-2
注：“*”为内标物质，因乙醇为酒中共有物质，故不对其含量详细探究；“-”表示未检出，下同。
由表1可以看出，FK3-2酵母发酵的蓝莓酒在发酵7 d、14 d及28 d时均可检测到12种挥发性物质，但在发酵21 d时仅检测到9种。在发酵7 d、14 d和21 d时，正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯及正丁醇含量含量较低，发酵28 d时明显增加，这可能是FK3-2酵母菌活力激发需要较长时间的缘故。
表2 LM6酵母发酵蓝莓酒15种挥发性物质含量测定结果
Table 2 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast LM6
由表2可以看出，LM6酵母发酵的蓝莓酒发酵7 d时检测到8种挥发性物质，发酵14 d时检测到13种，发酵21 d时检测到10种，28 d时可检测到11种。可见LM6酵母菌产生的挥发性物质种类整体呈上升趋势，其中正丙醇、异丁醇、异戊醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、正丁醇及仲丁醇含量在发酵28 d时分别为0.475 1 mg/mL、2.377 3 mg/mL、2.131 4 mg/mL、2.0533mg/mL、0.8548mg/mL、0.0420mg/mL、0.3678mg/mL。
表3 T1酵母发酵蓝莓酒15种挥发性物质含量测定结果
Table 3 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast T1
由表3可以看出，T1酵母发酵的蓝莓酒发酵7 d时可检测到11种挥发性物质，发酵14 d时可检测到12种，发酵21 d时仅可检测到7种，28 d时可检测到12种。正丙醇、异戊醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯及正丁醇含量在发酵28 d时增加至0.053 9 mg/mL、1.243 1 mg/mL、1.376 3 mg/mL、0.069 3 mg/mL、0.285 5 mg/mL、0.263 7 mg/mL。
酯类化合物具有花、果的香味[18]，是果酒香型的特征性成分，可以使酒体柔和、酒香绵长[19-20]。综合表1～表3可知，3种酵母发酵蓝莓酒的正丙醇和异戊醇含量均明显增加。发酵28 d时，LM6酵母发酵蓝莓酒中正丙醇和丁酸乙酯含量高于另外两种蓝莓酒，FK3-2酵母发酵蓝莓酒的异戊醇含量高于另外两种蓝莓酒。而且FK3-2酵母发酵蓝莓酒中正丙醇、丁酸乙酯、正丁醇及异丁醇含量较高；LM6酵母发酵蓝莓酒和T1酵母发酵蓝莓酒均是正丙醇和丁酸乙酯含量较高。这些醇类化合物主要来源于酵母菌的代谢、氨基酸分解转化等，其中的高级醇不但可以赋予酒优雅的香气，还为其他香味物质提供了良好溶剂，对酒的香型起着重要作用。
2.2 不同酵母发酵蓝莓酒有机酸含量比较
对3种酵母发酵蓝莓酒分别在主发酵7 d、14 d、21 d及28 d取样进行有机酸含量分析，结果见表4～表6。
表4 FK3-2酵母发酵蓝莓酒有机酸的含量检测结果
Table 4 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast FK3-2
表5 LM6酵母发酵蓝莓酒有机酸的含量检测结果
Table 5 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast LM6
表6 T1酵母发酵蓝莓酒有机酸的含量检测结果
Table 6 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast T1
由表4可知，FK3-2酵母发酵的蓝莓酒发酵7 d、14 d时检测到10种有机酸，发酵21 d和28 d时检测到9种有机酸。随着发酵时间的延长，所含酸的种类有所减少，L-苹果酸及琥珀酸含量在发酵28 d时分别降至0.1028 mg/mL、0.382 6mg/mL，柠檬酸含量分别由0.619 2 mg/mL和0.766 1 mg/mL降为0，而草酸含量由1.399 2 mg/mL增至2.620 4 mg/mL。
由表5可知，LM6蓝莓酒发酵7 d及14 d时可检测到10种有机酸，发酵21 d和28 d时可检测到9种。随着发酵时间的延长，所含酸的种类有所减少，柠檬酸含量由1.188 6 mg/mL逐渐降为0，草酸含量由2.9853mg/mL增至3.1702mg/mL，L-苹果酸、乳酸及琥珀酸含量降至0.089 5 mg/mL、9.871 5 mg/mL、3.061 2 mg/mL。
由表6可知，T1蓝莓酒发酵7 d、21 d及28 d检测到9种有机酸，14 d时检测到10种有机酸。随着发酵时间的延长，琥珀酸含量由0.444 8 mg/mL降为0.278 6 mg/mL，柠檬酸含量由0.014 9 mg/mL降为0，而α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增至0.233 3 mg/mL、0.029 3 mg/mL、3.368 2 mg/mL。D-苹果酸和L-苹果酸在14 d及21 d时含量有明显增加，增至2.632 8 mg/mL及1.890 5 mg/mL和0.482 8 mg/mL及0.321 4 mg/mL但在28 d时又大幅下降为0.089 4 mg/mL和0.030 7 mg/mL。
综合可知，发酵过程中3种酵母发酵的蓝莓酒柠檬酸含量逐渐下降，可能是在发酵过程中被微生物消耗或作为底物被利用。T1蓝莓酒中α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增多；LM6及FK3-2蓝莓酒中草酸含量增加，L-苹果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。有机酸有助于提高果酒的利口性，使酒体清爽[19]。这些有机酸一部分如苹果酸、柠檬酸、酒石酸等来自蓝莓果实本身，一部分如乳酸、琥珀酸等是发酵过程中微生物代谢产物，因此酸的含量的升降反映的是酵母菌的特性，该变化与挥发也有一定的关系。通过比较可知T1酵母菌产生的酸的种类略多，增加了口感的复杂性。
2.3 电子舌图谱分析
利用电子舌数据分析系统（SA402B）对发酵7 d、14 d、21 d及28 d的三种蓝莓酒进行分析，将其响应值作雷达图，结果见图1。
图1 3种不同酵母发酵蓝莓酒主发酵7 d（A）、14 d（B）、21 d（C）、28 d（D）的电子舌分析数据雷达图
Fig.1 Electronic tongue analysis of blueberry wine by three different yeasts at main fermentation for 7 d(A),14 d(B),21 d(C)and 28 d (D)
由图1可知，发酵7 d时，3种不同酵母发酵蓝莓酒味感相似，且T1与FK3-2几乎重合。三者均是咸味突出，鲜味较强，回味B和丰富性也强于其他味感，甜味不明显。发酵14 d时，三者涩味强于剩余味感，LM6蓝莓酒涩味最明显，T1蓝莓酒回味B比其他9种味感更明显。发酵21 d及28 d时，FK3-2蓝莓酒和T1蓝莓酒的雷达图几乎重合，皆是酸味突出，涩味较其他味感更明显。发酵21 d时LM6蓝莓酒10种味感较均衡，咸味、鲜味、丰富性略强于其他味感，但在发酵28 d时，LM6蓝莓酒的酸味变得突出。
FK3-2和T1酵母发酵蓝莓酒的味感在主发酵期基本上十分接近，表明两种酵母菌在发酵时产生的风味物质组合之间的相互作用能产生相似的味道，使人品尝时难以分辨，二者可相互替代；LM6酵母菌所产蓝莓酒的味感在发酵中趋于均衡但咸味、鲜味、丰富性更为突出，使果酒口感复杂柔和恰到好处。但在发酵28 d，该酒的酸味大大增强，可能是产生杂菌，使用时应注意避免染菌。
3 结论
通过气相色谱法、高效液相色谱法及电子舌检测发现不同的酵母菌株对蓝莓酒的挥发性物质含量、有机酸含量及咸味、回味、鲜味、丰富性等味感有不同程度的影响。
使用气相色谱法检测发现酵母菌LM6与酵母菌T1产醇类和酯类较多，形成的风味更为复杂。
使用高效液相色谱法检测发现T1酵母菌产生有机酸的能力略强于FK3-2和LM6。LM6和FK3-2酵母菌产有机酸性能相似，随着发酵时间的延长，皆是草酸含量增加，L-苹果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。
使用电子舌检测发现FK3-2和T1酵母菌产生的滋味基本一致，酸味明显；LM6酵母菌产生的鲜味、咸味及丰富性3种味感更明显，且在28 d时酸味大大增强。
酵母菌T1生产的蓝莓酒气味和利口性较好，酵母菌LM6生产的蓝莓酒气味和口感的复杂性较好，两者在香气、口感方面优于酵母菌FK3-2。酵母菌LM6生产的蓝莓酒更加馥郁可口。
[1]高明明，肖月欢，王幸，等.我国蓝莓食品加工现状分析[J].保鲜与加工，2017，17（3）：119-125.
[2]王鸿艳.蓝莓开发利用研究现状及发展前景[J].山西农经，2018，18（11）：64+67.
[3]聂飞，张玉春.我国蓝莓产业发展的机遇与挑战[J].北方园艺，2014，14（4）：165-170.
[4]王彦章，孙丽娜，赵志亮，等.蓝莓的研究概况[J].农村经济与科技，2018，29（8）：37-39.
[5] MILLER M G,HAMILTON D A,JOSEPH J A,et al.Dietary blueberry improves cognition among older adults in a randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Eur J Nutr,2018,57(3):1169-1180.
[6] STOTE K S,SWEENEY M I,KEAN T.et al.The effects of 100% wild blueberry(Vaccinium angustifolium)juice consumption on cardiometablic biomarkers:a randomized,placebo-controlled,crossover trial in adults with increased risk for type 2 diabetes[J].BMC Nutr,2017,3(1):1-11.
[7] KAZAN A,SEVIMLI-GUR C,YESIL-CELIKTAS O,et al.Investigating anthocyanin contents and in vitro tumor suppression properties of blueberry extracts prepared by various processes[J].Eur Food Res Technol,2016,242(5):693-701.
[8]蒋本庆，高铭坤.果酒的保健功效及蓝莓果酒发展分析研究[J].酿酒，2015，42（2）：115-118.
[9]陈祖满.蓝莓酒发酵过程中主要成分变化规律研究[J].中国酿造，2014，33（2）：93-96.
[10]郭成宇，安百慧.不同品种蓝莓和菌种酿制蓝莓酒的香气成分分析[J].中国酿造，2017，36（4）：174-179.
[11]WUNSCH M R,LEHNIG R,TRAPP O,et al.Continuous online process analytics with multiplexing gas chromatography by using calibrated convolution matrices[J].J Chromatogr A,2017,89(7):180-189.
[12]屈媛.野生蓝莓中花青素提取及高酒精度蓝莓酒的研制[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2019.
[13]李晓静，李腾，李永库，等.高效液相色谱法测定蓝莓果汁中11 种有机酸含量[J].河南工业大学学报（自然科学版），2018，39（1）：83-86.
[14]巴特尔达赖，王锡昌，吴娜，等.电子舌技术在真假伊力老陈酒鉴别中的应用[J].食品工业科技，2017，38（9）：290-293.
[15]KOBAYASHI Y,HABARA M,IKEZAZKI H,et al.Advanced taste sensors based on artificial lipids with global selectivity to basic taste qualities and high correlation to sensory scores[J].Sensors,2010,10(4):3411-3443.
[16]邓莉.电子舌对不同类型酒味觉的辨识研究[J].中国酿造，2018，37（7）：97-100.
[17]徐玉涛，李珂珂，王贺新，等.高效液相色谱法对蓝莓果实中8 个有机酸含量的测定[J].食品科学，2015，36（18）：127-131.
[18]周书来，唐勇，王琪，等.乐山3 种不同葡萄品种酿制葡萄酒品质对比分析[J].中国酿造，2018，37（1）：82-85.
[19]王芮东，李楠，赵燕飞，等.草莓、柿子复合果酒发酵过程中香味成分比较分析[J].食品工业科技，2018，39（21）：218-223，229.
[20]杨淇，吴正云，张文学.桂花酒的制备与其香气成分分析[J].食品科技，2017，42（2）：50-54.