在中国白酒的组成成分中，乙醇和水约占98%～99%，仅有1%～2%为微量成分，而白酒的质量和口味就由这部分微量物质所决定[1]。由于白酒中微量物质的种类和含量的不同[2]，导致中国白酒在香型和风格上差异很大，因此将中国白酒分为浓、清、米、酱、兼等香型[3]。其中浓香型[4]、酱香型[5]、清香型[6]和芝麻香型[7]等白酒中的香味物质都被广泛研究，而有关兼香型白酒中香味物质的分析报道很少。
兼香型白酒是指带有两种及以上香型风格特征的产品，是多种香型白酒的综合感官的协调体现。白云边酒是浓酱兼香型白酒的典型代表，既具有酱香型白酒的幽雅细腻又有浓香型白酒的回味爽净。然而，目前对兼香型白酒的研究主要集中于大曲、微生物多样性及功能[8-9]等方面，对其香味物质研究很少。
在白酒的前处理技术中，如搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）和顶空-固相微萃取（head space solid-phase micro-extractions，HS-SPME）等技术都常用于白酒香味物质的提取。LLE通常需要有机溶剂[10]，SDE操作时间冗长[11]，SBSE[12]所需成本昂贵且工艺复杂。相比之下，HS-SPME因无溶剂、耗时短、成本低、简单安全，可以将取样、富集、解吸和进样组合成一个步骤等优势而更广泛地用于白酒香味物质的提取[13]。此外，气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪作为一种成熟的检测器，可以准确快速地分离和确定目标物，已广泛地应用于白酒行业挥发性物质的分析[14]。因此，本研究采用HS-SPME结合GC-MS联用技术，研究兼香型年份酒中挥发性香味成分含量及其变化，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA），比较年份酒之间的差异，以期为兼香型白酒中香味物质的分析提供理论与实践指导，进而探索白酒中香味物质的形成机理。
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
5种白云边酒[分别为3年（3 Y），5年（5 Y），12年（12 Y），15年（15 Y）和20年（20 Y）酒精度均为42%vol]：湖北白云边酒业股份有限公司。
丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、3-甲基丁醇等26种标品、乙酸正戊酯（内标）、无水乙醇（纯度均＞97%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
50/30m DVB/CAR/PDMS萃取纤维：上海安谱实验科技股份有限公司；85-2A恒温磁力搅拌器：湖南前沿科技有限公司；DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890B-5977B气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 香味物质的提取
准确称量10 mL稀释后的酒样（酒精度14%vol）于30 mL顶空进样瓶中并密封。在磁力搅拌器中40 ℃平衡20 min后用已老化好的萃取头在顶空瓶液面上方（1～2 cm）富集20 min。最后在230 ℃的进样口中解吸5 min并进样。为防止样品间相互污染，两次进样间萃取头于240 ℃老化5 min。
1.3.2 GC-MS分析条件
GC条件：以氦气（He）（纯度99.999%）作为载气，恒定流速为0.7 mL/min，采用不分流模式。柱箱升温程序为45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min升至85 ℃，不保持，然后以4 ℃/min升至225 ℃，保持15 min。进样口温度230 ℃。MS条件：电子电离（electionic ionization，EI）源，四极杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，质量范围为30～550 m/z。
将质谱解析与美国国家标准技术研究所（national in stitute of standards and technology，NIST）14谱库的比对结果进行初步定性（匹配度＞90%）、再与已有标样的保留时间来进一步确认化合物结构。采用半定量法计算各物质含量。
1.3.3 模拟酒样的制备
分别取一定量的26种标样，以无水乙醇为溶剂定容于10 mL容量瓶中，得到标准储备液；标准储备液通过梯度稀释得到标准工作液，上述标样和溶液均在4 ℃保存备用。在乙醇溶液（酒精度14%vol）中加入一系列已知浓度的标准工作液制备成模拟酒样，建立标准曲线进行方法评价。其中检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分别在3倍和10倍信噪比下计算，向样品中添加一定量的标准工作液计算回收率。
1.3.4 重要香气物质的确定
通过计算化合物的香气活度值（aroma activity value，OAV）用来表征各化合物对香气贡献的大小。OAV的计算公式为：OAV=物质含量/物质阈值[15]。
通常认为OAV＞1的化合物对白酒香味有贡献，而OAV＞10的化合物视为重要香气物质。
2 结果与分析
2.1 萃取条件的优化
2.1.1 酒精度的选择[16]
本实验考察了酒精度（7%vol、14%vol、28%vol和42%vol（原酒样））对香味成分的萃取效果，结果见图1。
图1 酒精度对香味物质总数量和总峰面积的影响
Fig.1 Effect of alcohol content on the total quantity of aroma components and total peak area
由图1可知，从化合物总峰面积和总出峰个数而言，酒精度为14%vol的酒样均远高于其他3种酒精度。表明酒精度对香味物质的提取影响很显著。因此，选择酒样最适酒精度为14%vol。
2.1.2 萃取温度的选择[17-18]
本实验对比了萃取温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）对提取效果的影响，结果见图2。
图2 萃取温度对香味物质总数量和总峰面积的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the total quantity of aroma components and total peak area
由图2可知，总出峰个数和总峰面积在30～40 ℃时逐渐上升，并在萃取温度40 ℃达到最多，但在40～50 ℃迅速下降，到60 ℃时吸附量波动很小。因此，选择最适萃取温度为40 ℃。
2.1.3 萃取时间的选择[19]
本实验研究了萃取时间为20 min、30 min、40 min和50 min的萃取结果，结果见图3。
图3 萃取时间对香味物质总数和总峰面积的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the total quantity of aroma components and total peak area
由图3可知，萃取时间为20～30 min时，香味成分总数量和总峰面积随萃取时间增加而增大，从30 min以后吸附量增长不明显，说明吸附-解吸过程趋于平衡。因此，选择最适萃取时间为30 min。
2.1.4 解吸时间的选择[20]
本实验对比较了5 min、10 min、15 min和20 min的解吸效果，结果见图4。
由图4可知，随着解吸时间从5 min延长到20 min，物质的总峰面积和出峰个数几乎都没有增加，说明5 min的解吸时间已经足以将吸附物质完全解吸出来。考虑到萃取纤维的使用寿命和实验效率，最佳解吸时间为5 min。
图4 解吸时间对香味物质总数和总峰面积的影响
Fig.4 Effect of desorption time on the total quantity of aroma components and total peak area
综上，本实验以酒样酒精度为14%vol，萃取温度为40 ℃，萃取时间为30 min，解吸时间为5 min确定为HS-SPME最佳操作参数。
2.2 方法验证
通过可能有香气贡献的物质对优化方法进行评价，旨在检验该方法的可靠性，结果见表1。由表1可知，各标样的线性相关系数（R2）除油酸乙酯（0.988 6）和正丁酸（0.986 7）外，其他标样相关系数（R2）均＞0.991 6。LOD和LOQ分别为0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，低于文献报道值[21]。采用标准加入法对方法的回收率进行评价，除2-苯乙醇的加标回收率为77.8%外，其他物质的回收率为81.1%～115.3%，大部分都在80%～120%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜14.8%，表明此方法准确性和精密度良好，能应用于白酒香味成分分析中。
表1 方法的相关系数和线性范围、定量限和检测限、回收率和精密度
Table 1 Correlation coefficients,linear ranges,LOQ,LOD,recovery rates and RSD of the method
续表
2.3 年份酒的挥发性风味物质分析
采用已建立的HS-SPME结合GC-MS法对五种兼香型白酒中挥发性化合物进行分析，结果见表2。
由表2可知，共鉴定出67种化合物，包括50种酯类（含量80.25%），3种醇类（含量0.17%），5种酸类（含量19.33%），1种芳香族化合物（含量0.04%），1种含硫化合物（含量0.001%），2种呋喃类（含量0.05%），3种酮类（含量0.05%）和2种醛类（含量0.06%）。从化合物数量和含量上可以看出，酯类物质在兼香型白酒中最丰富，其次为酸类和醇类物质，其他物质相对较少。
表2 白云边年份酒中67种风味成分分析结果
Table 2 Analytical results of 67 flavor compounds in Baiyunbian aged Baijiu
续表
注：“ND”表示未检出。
酯类主要呈现出花香和果香，在构成各白酒典型性中起着关键作用[22]，其种类和含量是白酒中最丰富的一类家族。兼香型白酒随着年份的增加酯类含量明显增加，3Y、5Y、12Y、15Y和20Y总酯含量分别为1598.13mg/L、1743.20mg/L、1 775.40 mg/L、1 808.13 mg/L和1 844.76 mg/L，说明酯类物质主要以酯化反应为主。其中己酸乙酯在3Y、5Y、12Y、15Y和20Y年中分别为1449.80mg/L、1547.43mg/L、1511.22 mg/L、1 535.82 mg/L和1 541.67 mg/L，在酯类物质中的含量最高。其次为丁酸乙酯和戊酸乙酯，含量分别在62.80～161.42 mg/L和33.98～59.62 mg/L范围内。含量较高的酯类物质还有辛酸乙酯（10.05～23.59 mg/L）、己酸己酯（12.91～28.76 mg/L）、庚酸乙酯（7.89～15.23 mg/L）、丁酸乙酯和辛酸乙酯含量随年份的增加而升高；戊酸乙酯和己酸己酯含量随年份的增加先升高后降低，且二者都在12 Y中含量最高。
醇类作为白酒中的微量助香剂，使酒体香味独特，对促进酒体丰满醇厚和醇甜感浓郁起着关键作用[23]。本次实验一共检测出3种醇类物质，总醇含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒样中分别为1.86 mg/L、1.23 mg/L、1.51 mg/L、7.95 mg/L和6.33 mg/L。3-甲基丁醇在酒体中含量最高，但仅在12 Y（5.64 mg/L）和15 Y（4.47 mg/L）中检测出，在白酒发酵过程中脱氨基和脱羧反应产生的燃烧香味即由3-甲基丁醇产生[24]。此外，2-苯乙醇含量在五个年份酒中稳定在1.09～1.94 mg/L，也是白酒中重要的香气物质，2-苯乙醇具有蜜香玫瑰味，使酒体具有清雅香气和绵甜清爽之感[25]。辛醇含量最少且仅在3 Y、5 Y及15 Y中出现，其含量分别为0.19 mg/L、0.14 mg/L和0.37 mg/L。
酸类是促成白酒香味的主要贡献者之一，也是酯类的前驱物质。大多数有机酸是在发酵过程中由细菌产生[26]。在酒样中检测到的总酸含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒样中分别为277.56 mg/L、357.91 mg/L、480.74 mg/L、471.91 mg/L和523.65 mg/L，随年份的增加呈上升趋势。正己酸能产生温和宜人的甜香和奶酪香[27]，其含量在酸类物质中最高（275.52～517.03 mg/L），呈增长趋势。辛酸也呈上升趋势，含量为1.28～4.98 mg/L。丁酸仅在20Y酒样中发现，其含量为1.13 mg/L；而戊酸、庚酸等酸类含量都＜1 mg/L。
呋喃类在我国白酒中报道较多的是糠醛类物质，糠醛主要在白酒中产生涩味和焦香[28]。在兼香型白酒中检测到两种呋喃类物质，5-甲基-2-糠醛除了3 Y外，其他四个酒样中都有被检测，其含量分别为0.23 mg/L、0.40 mg/L、0.47 mg/L和0.68 mg/L。己酸糠酯含量随年份呈上升趋势，在3 Y、5 Y、12Y、15Y和20Y酒样中分别为1.10mg/L、1.54mg/L、1.35mg/L、2.38 mg/L和2.48 mg/L。
芳香族化合物具有花香和蜂蜜芳香，其主要形成于原料中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的降解[29]。如上文已介绍的少量2-苯乙醇的蜜香玫瑰味使酒具有清雅香气和绵甜清爽之感，在五个样品中分别检测出1.67 mg/L、1.09 mg/L、1.51 mg/L、1.94 mg/L和1.86 mg/L。醛类物质赋予一种“香、爽”的口感，对白酒独特性起着重要作用，浓度过高容易产生苦味[30]。与醛类相比较，酮类的香气更为绵柔细腻，具有花香和果香。苯甲醛具有杏仁和焦糖的气味，在醛酮类物质中含量最高，在3 Y、15 Y和20 Y中分别为1.21 mg/L、2.12 mg/L和1.90 mg/L。
随着年份的增加，香气成分从微妙动态变化到趋于稳定，使兼香型白酒浓酱协调、芳香优雅、绵厚爽甜、圆润怡长、典型性突出。
白酒香味物质浓度并不能判断其对香气贡献程度的大小，而是考察OAV的大小。参考香味化合物阈值[31]，对五种兼香型白酒香味成分进行OAV分析，结果见表3。由表3可知，己酸乙酯的OAV＞10 000，丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯和己酸己酯的OAV＞1 000，己酸、二甲基三硫的OAV＞100，十四酸乙酯、萘的OAV＞10。因此OAV＞10的化合物共9种，视为重要香气物质。其中酯类占绝大部分，是白云边年份酒中最重要的香气成分。丁酸-3-甲基丁酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、己酸异戊酯、辛酸-3-甲基丁酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、丁酸、戊酸、辛酸2-壬酮、2-十一酮和壬醛的OAV均＞1，这13种成分视为对酒香味有贡献。这22种香味物质赋予兼香型白酒突出的花香、果香、甜香、醇香等香味，其余物质OAV均＜1。
表3 兼香型年份酒中22种香味成分的香气活度值
Table 3 Odor activity values determined for 22 compounds in strong-sauce-flavor aged Baijiu
3 结论
建立了一种分析兼香型白酒香气物质的HS-SPME的方法，最佳萃取条件为酒样酒精度14%vol，萃取温度40 ℃，萃取时间30 min，解吸时间5 min。LOD和LOQ范围分别为0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，大多数物质的回收率为81.1%～115.3%，RSD均＜14.8%。
在五种兼香型白酒中共鉴定出67种挥发性风味化合物，其中酯类、醇类、酸类和呋喃类总含量呈现上升趋势，芳香类物质呈现先上升后略有下降趋势，醛类、酮类化合物含量变化规律不明显。随着年份的增加，香气成分从微妙动态变化到趋于稳定，使兼香型白酒浓酱协调、芳香优雅、绵厚爽甜、圆润怡长、典型性突出。
确定出22种（OAV＞1）具有香味贡献的物质，其中有9种为重要的香气成分（OAV＞10），这22种香味物质赋予兼香型白酒突出的花香、果香、醇香、甜香等香味。为进一步分析兼香型白酒香味物质提供理论与实践指导，进而探索白酒中香味物质的形成机理，对今后白酒的酿造生产，稳定并提高年份酒产品质量具有重要的意义。
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