黄豆酱又称豆酱、黄酱、大酱等，是以黄豆、面粉为主要原料，食盐、水为辅料，利用米曲霉（Aspergillus oryzae）为主要微生物，经发酵而成的半流动状态的食品，是我国北方传统的豆制发酵食品，因其独特的风味特征而广受消费者的喜爱[1]。黄豆酱发酵最初接种单菌种进行制曲，但单菌种所形成的酶系比较单一，使得蛋白质和糖分分解不彻底，发酵基质利用率低。近年来，研究者致力于通过丰富曲中的微生物或其酶系来提高发酵食品的品质。李志江等[2]利用米曲霉和黑曲霉共培养制作黄豆酱酱曲，有效提高了曲中各酶系的活性；古小露[3]接种复合菌进行制曲和发酵，有效提高了豆酱的氨基酸态氮和总酯的含量。
红曲霉（Monascus）是自然界中广泛存在的一类丝状腐生真菌，作为我国传统食品的发酵用菌，红曲霉在中国的应用已有上千年的历史，是我国重要的微生物资源。红曲霉不仅能产生红曲色素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和Monacolin K等多种功能物质，且可产生淀粉酶、糖化酶、酯化酶等多种酶，在酿酒等发酵行业有着广泛的应用[4]。杨爱华等[5]在郫县豆瓣曲中添加红曲霉和米曲霉，不仅改善了郫县豆瓣的色价和感官品质，还提高了郫县豆瓣的营养价值。酱渣也称酱油渣或酱油糟，是酱油生产中原料发酵后产生的固体残渣。其中含有丰富的糖、粗蛋白、纤维和油脂等营养物质，还含有丰富的多肽、异黄酮和蛋白黑素等生理活性物质，具有较大的再利用价值[6]。我国酱油年产量巨大，由此产生的副产物酱渣的量也非常可观，酱渣水分含量大，运输困难，又极易腐败变质，如果不能有效处理就会给环境造成负担。徐晗等[7]研究了酱渣添加对黄豆酱品质的影响，结果表明，添加适量酱渣可在一定程度上提高黄豆酱的风味。
本研究采用米曲霉与红曲霉混合培养制备黄豆酱大曲，并在发酵基质中添加适量酱渣，改良黄豆酱的发酵体系，对黄豆酱发酵过程中各理化指标的动态变化进行监测，并分析了纯黄豆酱与改良后的黄豆酱在感官指标上的差异，旨在阐明混合制曲和酱渣添加对黄豆酱理化指标及感官品质的影响，为丰富黄豆酱发酵微生物资源和酱渣的高值化利用提供参考，在微生物混合制曲缩短豆酱发酵周期、提高酱渣利用率、进一步丰富豆酱市场的产品种类和结构等方面具有一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱渣（含水量69%，含盐量14%）、米曲霉（Aspergillus oryzae）沪酿3.042：天津市利民调料有限公司；面粉、黄豆、食盐：市售；紫色红曲霉（Monascus purpureus）：天津科技大学发酵食品与益生菌开发实验室；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：上海科丰化学试剂有限公司；硝酸银（分析纯）：西格玛奥德里奇贸易有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市化学试剂供销公司。
1.2 仪器与设备
T1000 分析天平：日本SHIMADZU公司；SevenEasy pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；CL-32L 高压灭菌锅：日本ALP公司；QP2010 Ultra 气质联用仪：日本岛津公司；TE32 TA.XT.Plus 质构仪：英国Stable Micro System公司；CM-5 色差仪：柯尼卡美能达投资有限公司；M200 PRO酶标仪：帝肯（上海）贸易有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵种曲的制备
米曲：单独接种米曲霉，接种量为0.04%，30 ℃培养48 h。
混合曲：红曲霉与米曲霉混合接种，其中米曲霉接种量为0.04%，红曲霉接种量为1.5%，将混合物料装盘置于恒温培养箱，30 ℃堆积培养至16 h翻曲一次，继续堆积培养8 h后进行第二次翻曲，平铺培养48 h。
1.3.2 黄豆酱制作工艺流程
操作要点：
将面粉与种曲混合均匀，与冷却至40 ℃左右的黄豆进行拌合，黄豆与面粉干质量比为4∶1。
纯黄豆酱发酵所用种曲为米曲，其接种量为原料干质量的0.04%，60 g成曲与盐水（含盐量90%）以1.0∶0.9的比例混合于240 mL玻璃瓶中制成发酵醅，40 ℃恒温发酵30 d；接种红曲酱渣酱发酵所用种曲为混合曲，其接种量为原料干质量的0.04%，以10%酱渣代替成曲，与盐水（含盐量90%）以1.0∶0.9的比例混合制成发酵醅，40 ℃恒温发酵30 d，每个条件下均设置3个平行发酵样品。制酱操作要点具体参照文献[7]。
1.3.3 测定方法
氨基酸态氮和总酸含量的测定：采用酸度计法测定总酸和氨基酸态氮，具体参照GB 5009.235—2016 食品中氨基酸态氮的测定[8]。
还原糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定黄豆酱还原糖，具体参照文献[9]。
盐分测定：采用银量法测定黄豆酱盐分，具体参照GB 5009.44—2016 食品中氯化物的测定[10]。
黄豆酱色差测定：采用CM-5型色差仪测定成品酱亮度、红色指数及黄色指数，读数以CIE1976色度空间值L*（暗→亮：0→100）、a*（绿→红+）、b*（蓝→黄+）表示，具体操作参照文献[7]。
黄豆酱质构测定：利用TA.XT.Plus型质构仪对成品酱硬度、稠度、内聚性和粘性指数进行测定，具体操作参照文献[7]。
黄豆酱风味物质测定：采用固相微萃取-气质联用对黄豆酱中的风味物质进行测定。具体方法设置参照文献[7]。风味物质的定性分析：将质谱仪记录的质谱图和计算机检索谱库的标准质谱图进行对照，鉴定、分析化合物，确定豆酱的风味物质。
黄豆酱的感官评定：黄豆酱的感官评定采用评分法。根据国标GB/T24399—2009《黄豆酱》[11]感官要求制定感官评定表1。由12名食品专业的研究生根据表中的4个感官指标进行品评和打分，统计各指标的评定结果，比较两种黄豆酱的感官差异。
表1 黄豆酱感官评定标准
Table 1 Standards of sensory evaluation of soybean paste
2 结果与分析
2.1 发酵过程中黄豆酱理化指标的动态变化
2.1.1 氨基酸态氮含量的动态变化
图1 两种黄豆酱发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
Fig.1 Change of amino acid nitrogen contents in two kinds of soybean paste during the fermentation
由图1可知，发酵前7 d，两种黄豆酱的氨基酸态氮含量均随发酵时间的延长而急剧上升，豆酱中微生物代谢产生的大量蛋白酶将蛋白质降解为游离氨基酸和小分子多肽，使得氨基酸态氮含量迅速增加；发酵8～21 d，两种黄豆酱的氨基酸态氮含量增速变缓，此时微生物生长处于动态平稳期，蛋白质水解作用增速减缓，但接种红曲酱渣酱的氨基酸态氮含量始终高于纯黄豆酱，这可能是由于红曲霉与米曲霉生长的协同作用使得蛋白酶含量有所提高；发酵30 d时，两种黄豆酱的氨基酸态氮含量无显著差异（P＞0.05），这表明红曲霉的加入只能加速氨基酸态氮的产生，而对其最终产量影响不大。
2.1.2 总酸含量的动态变化
发酵过程中总酸含量的变化对豆酱的色泽、风味、稳定性及内源酶的活性都有重要影响。由于酸类是发生酯化反应的物质基础，一定含量的有机酸还可以提升黄豆酱的风味[14]。
图2 两种黄豆酱发酵过程中总酸含量的变化
Fig.2 Change of total acid contents in two kinds of soybean paste during the fermentation
由图2可知，发酵前14 d，随着发酵时间的延长，两种黄豆酱的总酸含量均呈逐渐上升趋势，此阶段总酸含量迅速积累，酱醪的pH也随之迅速降低，此后接种红曲酱渣酱的总酸含量出现短暂的下降，可能是由于总酸的生成量与参与酯化等反应的消耗量未达到平衡造成的；整个发酵过程中接种红曲酱渣酱的总酸含量均高于对照组，可能的原因是红曲霉产生的糖化酶促进了还原糖含量的提高，而其中一部分还原糖转化成了有机酸，这也表明红曲霉的添加可以加速豆酱有机酸的积累；发酵终止时，两种黄豆酱的有机酸含量基本相同，这说明发酵周期为30 d时，红曲霉和酱渣的添加对黄豆酱的有机酸含量没有明显的影响。
2.1.3 还原糖含量的动态变化
发酵过程中，淀粉在糖化酶作用下水解产生还原糖，还原糖与氨基酸发生美拉德反应，其反应产物不仅有较强的抗氧化性，还具有抗过敏、降血压及调节肠道功能的作用[15-16]。酱渣中粗脂肪含量较高，容易发生脂质过氧化反应，所以还原糖不仅能丰富黄豆酱的滋味，还能保持酱渣黄豆酱的品质。
图3 两种黄豆酱发酵过程中还原糖含量的变化
Fig.3 Change of reducing sugar contents in two kinds of soybean paste during the fermentation
由图3可知，发酵过程中两种黄豆酱的还原糖含量均呈先上升后下降的趋势。发酵前14 d，发酵过程中产生的还原糖大量溶出，还原糖含量持续升高；此后，微生物开始消耗还原糖促进自身生长，盐浓度的升高在一定程度抑制了淀粉酶酶活，使得还原糖生成量下降，而部分还原糖还会与氨基酸结合形成色素[17]，加速还原糖的消耗，因此在发酵14～21 d这一阶段，还原糖含量呈下降趋势；整个发酵过程中，接种红曲酱渣酱的还原糖含量明显高于纯黄豆酱，且在第7天和第14天时，两种豆酱还原糖含量有显著差异（P＜0.05），这可能与红曲霉参与制曲有关，红曲霉在制曲过程中产生的糖化酶、纤维素酶等其他淀粉酶系有利于进一步分解酱渣中的淀粉和纤维素，从而产生更多的还原糖，这一点为黄豆酱的色泽和风味的改善做出非常大的贡献，且可在一定程度上缩短黄豆酱的发酵周期。
2.1.4 盐分及水分含量的动态变化
黄豆酱中的食盐可作为其保鲜剂和增鲜剂，抑制酱中杂菌生长，防止豆酱腐败变质；但盐度过高也会抑制不耐盐优势菌的生长，影响豆酱的口感和食用者的健康，而盐度过低又会导致黄豆酱鲜味不足[18]。
由图4、图5可知，随着发酵时间的延长，两种黄豆酱的盐分呈比较平稳的增长趋势，这可能与黄豆酱中水分含量逐渐降低有关；在整个发酵过程中，纯黄豆酱的盐分含量均高于接种红曲酱渣酱，但发酵结束时，两种黄豆酱的盐分含量趋于一致，这说明红曲霉和酱渣的添加对黄豆酱的盐分含量几乎没有影响。
图4 两种黄豆酱发酵过程中盐分含量的变化
Fig.4 Change of salt contents in two kinds of soybean paste during the fermentation
图5 两种黄豆酱发酵过程中水分含量的变化
Fig.5 Change of water contents in two kinds of soybean paste during the fermentation
2.2 成品酱指标对比分析
2.2.1 色差
食品的色泽对其感官品质有着极为重要的影响，对黄豆酱而言，一定的光泽和鲜艳的红色能够很好的促进消费者的食欲。由表2可知，与纯黄豆酱相比，接种红曲酱渣酱的红色指数明显高于纯黄豆酱，且差异显著（P＜0.05），这说明适当接种红曲霉进行混合菌种制曲可以有效改善黄豆酱的色泽。
表2 两种黄豆酱色差的对比
Table 2 Comparison of color difference of soybean sauce
注：同一列不同字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。下同。
2.2.2 质构
食品的质地是影响消费者对产品质量感觉的重要因素。它对食物的体态、口感及质量稳定性都有较大影响，两组黄豆酱的质构指标见表3。
由表3可知，接种红曲酱渣酱比纯黄豆酱显示出更高的硬度、稠度、内聚性和粘性，且差异显著（P＜0.05）。与纯黄豆酱相比，接种红曲酱渣酱添加了10%的酱渣，这对黄豆酱的固形物含量有较大影响，此外，红曲霉的加入提高了大曲酶活，使得基质中蛋白质和脂肪进一步分解成游离氨基酸，小分子肽和游离脂肪酸，分子体积的变小和浓度的增加使得分子之间、分子与溶剂之间作用加强，酱缸中液体成分逐渐变稠，硬度增加[19]。综上，采用添加红曲霉混合制曲及在发酵基质中添加酱渣的方式可有效增强豆酱稠度、内聚性及粘性指数，有利于形成豆酱特有的流变学特性，提升消费者的喜好感，保持豆酱质量稳定，延长豆酱储藏期。
表3 黄豆酱质构的对比
Table 3 Comparison of texture difference of soybean sauce
2.2.3 风味物质
两组黄豆酱风味物质的比较见表4及表5。
表4 黄豆酱风味物质的对比
Table 4 Comparison of flavor substances of soybean sauce
续表
注：“-”表示未检出。
表5 两种黄豆酱风味物质比较
Table 5 Comparison of flavor substances of two kinds of soybean sauce
由表4及表5可知，纯黄豆酱中有34种风味物质，接种红曲酱渣酱中有57种风味物质；两种黄豆酱在醛类物质的种类上没有明显差异，可能的原因是酱渣干燥储存过程中油脂氧化分解，有机酸和小分子物质进一步反应导致醛类物质含量下降。
接种红曲酱渣酱的酯类物质种类明显比纯黄豆酱丰富很多，可能是红曲的酯化力促进了发酵过程中酯类化合物的积累，另外酱渣丰富的油脂在脂肪酶系的作用下，水解成甘油和脂肪酸，脂肪酸被降解或氧化生成各种单不饱和脂肪酸、多不饱和酸、短链脂肪酸、烷烃以及烯烃，此类化合物被进一步氧化和环化也可生成各种醛、酮、内酯、杂环化合物和烷基呋喃等香气物质[20]。豆酱中的酯类化合物具有高挥发性，极易被人的嗅觉所感知，其不仅是豆酱香气的重要组成成分，而且对一些具有刺激性的风味有抑制作用，添加红曲混合制曲和在发酵基质中添加酱渣均对豆酱的风味有良好的改善作用。
2.2.4 感官对比
根据表1 中的感官评定标准评价两种黄豆酱样品的品质，结果见表6。
表6 两种黄豆酱感官评分比较
Table 6 Comparison of sensory evaluation of two kinds of soybean paste
由表6可知，接种红曲酱渣酱比纯黄豆酱有更好的感官品质，这表明在接种红曲霉进行混合制曲的条件下将酱渣应用于黄豆酱中，不仅不会降低其品质还能使其感官品质有所改善。
3 结论
采用米曲霉与红曲霉混合接种制曲，并在发酵基质中添加适量酱渣，研究纯黄豆酱与接种红曲酱渣酱在理化指标和感官品质方面的差异。结果表明，接种红曲酱渣酱的氨基酸态氮含量较纯黄豆酱无显著性差异（P＞0.05），但红曲霉的添加可明显加速豆酱还原糖的产生，具有缩短豆酱发酵周期的潜力；酱渣的添加显著提高了黄豆酱的硬度和稠度（P＜0.05），增强了黄豆酱的内聚性和粘性（P＜0.05）；接种红曲酱渣酱在风味物质种类和感官评分上均优于纯黄豆酱。综上所述，红曲霉和酱渣的添加可在一定程度上改进黄豆酱的品质，本研究对混合接种制作酱曲及酱渣的高值化利用具有一定的参考价值。
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