近些年来与米香型白酒风味相关的研究方兴未艾，主要集中在白酒发酵工艺与原料的探索[1]、酒体后期催陈效果研究[2]、不良苦味的消除[3]以及功能菌的增香效果评估[4]等。本课题组前期也针对性地做了产香酵母的筛选与产酯规律研究[5]，为米香型白酒的风味改善提供了技术支撑，但均未对改善风味的工艺进行进一步分析和优化。
酒曲是富含微生物的发酵引物，素有“曲是酒中骨”的说法[6]。米曲是指以大米粉、米糠等为原料，经接种种曲后制备得到的一类优质酿酒小曲，有以生料制曲的邛崃米曲，以熟料制作颗粒曲与散曲的厦门白曲，以及绍兴酒药、宁波白药等[7-8]。
国外在酿酒领域对于产香酵母的利用较为深入，普遍将其作为生物香料以增加产品的香气多样性，而相关的研究也不断证实了产香酵母对于酿酒的积极作用[9]。将产香酵母用于制曲，丰富微生物的种系，对于酒体质量的提升有良好促进作用。
本研究将异常维克汉逊酵母（Wickerhamomycesanomalus）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kudriazevii）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共培养制作复配酵母种，通过对米曲制备中影响因素进行研究，利用单因素试验及响应面法对风味米曲的制备工艺进行优化，并评估了风味米曲的酿造可行性。旨在通过丰富酒曲中的功能性微生物来改善米香型白酒酒体风味。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验原料与菌株
一级籼米：金健米业股份有限公司；生麦芽：泉州市麦芽有限公司；小曲（广西小曲样品A、四川小曲样品B、厦门小曲样品C）：满盅花酿酒设备厂；米根霉（Rhizopus oryzae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kudriazevii，PK）、异常维克汉逊酵母（Wickerhamomyces anomalus，WA）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera，SF）：本实验室筛选鉴定得到并保藏的菌种。
1.1.2 化学试剂
重铬酸钾、无水乙醇、酚酞、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司；盐酸、硫酸：广州凯茵化工有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
米曲汁培养基：参照黄慧芬等[5，10]的方法制备；麦芽汁培养基：参照陈小龙等[11]的方法制备，于115 ℃下高压灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
LRH-150生化培养箱：上海一恒科技有限公司；HZQ-C气浴恒温摇床：常州恒隆仪器有限公司；YXQ-LS-75G全自动数显高压灭菌器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；BM1000生物显微镜：江南永新光学仪器有限公司；UV-2600紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；DK-98-2电热恒温水浴锅：上海虔钧科学仪器有限公司；5804R台式高速冷冻离心机：艾本德中国有限公司；JH-H5快速水份测定仪：泰州市宜信得仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 风味米曲制曲工艺流程及操作要点[12]
操作要点：
粉碎过筛：取籼米粉碎后过60目筛，作为米曲培养的原料。
灭菌、打散：将米粉在121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后，趁热打散。
米根霉固体米粉种曲制备：用米根霉制备纯种固体米粉种曲[13]。
复配酵母共培养种子液的制备：取SC及3株产香酵母PK、WA、SF菌株试管种，挑取一环接种于装有50 mL YPD液体培养基的100 mL三角瓶中，于30 ℃、150 r/min气浴摇床中活化24 h，将上述3株产香酵母种子活化液以106∶106∶106（CFU/mL）的比例接种到米曲汁培养基中，于30 ℃培养8 h后，再以106 CFU/mL的浓度接种SC种子活化液，继续共培养24 h，制得复配酵母共培养种子液。
接种培养：在灭菌后打散的米粉中加入25%无菌水，接种5%米根霉种，再接种酵母共培种，32 ℃培养72 h至米粉结块良好，翻曲培养至米曲成熟后出箱，得到风味米曲。
1.3.2 风味米曲试饭的制备[13]
米香型白酒原料为大米，根霉曲直接接种米饭作为糖化发酵剂，采用试饭的方法来检测风味米曲的质量。
试饭的制备：取籼米50 g，按米水比1∶1.2（g∶mL）加水，115 ℃高压灭菌15 min，用无菌药匙趁热搅散，要求饭质量等于大米和所加水量之和，不足部分用无菌水补足，待米饭凉至35 ℃左右，以大米质量1%的比例（即0.5 g）称取风味米曲均匀地拌和到米饭中，在30 ℃固态糖化24 h后，以大米质量的150%加水密闭发酵3 d。测定其试饭的感官评分、酯和乙醇含量。
1.3.3 风味米曲制备工艺优化单因素试验
在接种根霉固体种曲后8 h再接种液体酵母种共培养制备米曲的基础上，分别考察培养温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、培养时间（36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）以及酵母添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）对风味米曲制备的影响。
1.3.4 响应面法优化风味米曲制备工艺
在单因素试验的基础上，选取风味米曲制备的关键影响因素酵母接种量（A）、培养时间（B）、培养温度（C）进行考察，以试饭酯含量（Y）为响应指标进行Box-Behnken响应面设计优化，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.5 分析检测
（1）试饭指标
试饭酯含量的测定参照卢亭等[14]的方法；试饭乙醇含量的测定参照吴琼燕[15]的方法；按国标GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》[16]中白酒中风味评价的标准并参照吴琼燕[15]等的品评方法进行试饭感官评价。
（2）风味米曲理化指标
采用快速水分测定仪测定风味米曲水分含量；参照马歌丽等[17]的方法测定风味米曲糖化力；参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[18]测定风味米曲的发酵能力。
1.3.6 风味米曲的半固态发酵验证
对响应面优化制曲工艺进行试饭验证后，以市场上的3种小曲样品A、B、C作为对照，将风味米曲作为酿造酒曲进行半固态发酵验证。取籼米1 000 g，按照1.3.2中的方法进行处理并摊凉后，按米质量的1%取酒曲均匀地拌和到米饭中，在30 ℃固态糖化24 h后，加水150%，密闭发酵7 d。将发酵繆取出进行常压蒸馏，截取头酒后，将中段酒接至56%vol后停止接酒，并测定酒体总酸总酯含量，同时参照米香型白酒品评方法对酒体进行感官评价[5]。
2 结果与分析
2.1 风味米曲制备工艺优化单因素试验
2.1.1 不同培养温度对风味米曲试饭指标的影响
图1 培养温度对试饭指标的影响
Fig.1 Effect of culture temperature on testing indicators of steamed rice
由图1可知，随着培养温度的不断上升，试饭指标均呈现出先升后降的趋势，其中试饭酯含量与感官评分变化趋势一致，在26～30 ℃的培养温度范围内逐渐增高，在30 ℃时达到峰值，分别为3.04 g/L与86分，继续升温会导致两者均出现大幅度下降。试饭乙醇含量随着温度在26～33 ℃范围增加逐渐升高，并在32 ℃达到最大值（59.23 g/L），继续升温试饭乙醇含量减少。综合考虑，选择最适培养温度为30 ℃。
温度是影响微生物生长的重要因素，但菌体生长的最适温度与代谢产物累积的最佳温度通常并不相符，这可能与发酵体系中的物质基础相关，代谢产物的生成会受到发酵体系中的物质调控，与ROLLERO S等[19]的研究结果一致。
2.1.2 不同培养时间对风味米曲试饭指标的影响
图2 培养时间对试饭指标的影响
Fig.2 Effect of culture time on testing indicators of steamed rice
由图2可知，培养时间在36～72 h内，试饭酯含量、乙醇含量与感官评分3个试饭指标均随着培养时间的延长逐渐增高，并在72 h出现了峰值，分别为3.05 g/L、58.37 g/L以及87分。培养时间＞72 h之后，试饭酯含量、乙醇含量稍微下降，感官评分出现了较大程度的降低。综合考虑，选择最适培养时间为72 h。
2.1.3 不同酵母接种量对风味米曲试饭指标的影响
酒曲微生物的菌群多样性与酒体中各种微量成分的形成密切相关，不同的接种比例会直接影响到代谢物质的含量[20]。
图3 酵母接种量对试饭指标的影响
Fig.3 Effect of yeasts inoculum on testing indicators of steamed rice
由图3可知，酵母接种量在0.6%～1.0%范围内增加，试饭酯含量、乙醇含量及感官评分也随之升高，3个指标均在1.0%的接种比例下达到峰值，分别为3.46 g/L、65.35 g/L以及91分。随着接种量的进一步增加，3个试饭指标均随之降低，继续加大酵母接种量不利于发酵平衡以及产物的代谢。综合考虑，选择最适酵母接种量为1.0%。
产香酵母可通过生物转化形成芳香酮以及酯类物质[21]，在一定范围内，增大产香酵母的接种比例可增加其代谢产物的浓度，但超出适宜范围之后，会对根霉的生长造成不利影响，这可能是引起试饭指标下降的一个重要原因。
2.2 风味米曲制备工艺优化的Box-Behnken响应面试验
2.2.1 Box-Behnken 响应面设计与结果
根据单因素试验结果，以试饭酯含量（Y）为响应值，选择显著影响试饭指标的因素酵母接种量（A），培养温度（B）、培养时间（C）进行Box-Behnken响应面优化，结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计结果
Table 2 Results of Box-Behnken experiments design
续表
对试饭酯含量（Y）进行二次项模型的回归拟合分析，得到回归方程为：
2.2.2 试饭酯含量的方差与可信度分析
进一步对表2各组试验的结果进行方差分析，结果见表3。
由表3可知，针对试饭酯含量选用二次项模型进行回归拟合，模型P值＜0.000 1，具有极显著差异，拟合精度良好，可用该模型进行后续的优化分析；同时失拟项P值＞0.05，差异不显著，说明该二次项模型在整个回归区域类拟合较好[22]，试饭酯含量的模型拟合成功。同时，从各因素在模型拟合中的P值来看，一次项A、B、C，二次项A2与C2对试饭酯含量有极显著的影响（P＜0.01）；交互项AB、AC对试饭酯含量有显著性的影响（P＜0.05）。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
模型的决定系数R2与调整决定系数R2adj分别为0.992 6、0.981 8，证明拟合后99.26%的试饭酯含量可由模型解释，98.18%的变化来源于考察的变量，调整优化后的模型能充分说明工艺情况。变异系数为1.486 1%，在实验范围内的变异较小，数据的离散程度在可接受范围内。
2.2.3 试饭酯含量的响应面分析及验证试验
对风味米曲试饭指标的响应面进行分析，各因素交互作用对试饭酯含量影响的响应面及等高线见图4。
图4 酵母接种量、培养温度、培养时间交互作用对试饭酯含量影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum,culture temperature and time on ester contents of steamed rice
由图4可知，AB、AC交互作用对于试饭酯含量均有显著影响，以试饭酯含量为响应指标，拟合出的最佳制备工艺参数为酵母接种量1.03%、培养温度30 ℃、培养时间72.98 h，此优化条件下试饭酯含量预测值为3.64 g/L。为了便于实际操作，将理论最优的风味米曲制备工艺修正为酵母接种量1.0%，培养时间73 h，培养温度30 ℃。在此优化制备工艺条件下，得试饭的酯含量实际值为3.65 g/L，与理论值基本一致，表明响应面拟合成功，可为实际的制曲提供参考。
2.3 风味米曲的质量指标检测
由图5可知，4种小曲的水分含量均≤13%，其中小曲A的水分含量最高，与其余3种小曲相比差异具有显著性（P＜0.05），而小曲C、小曲B、自制风味米曲则无明显区别（P＞0.05）。风味米曲的糖化力达到423.77 U/g，与小曲A、小曲B无明显差异（P＞0.05），但显著高于小曲C（P＜0.05）。而从发酵力指标可看出，风味米曲达到2.24 g/（g·72 h），与其余小曲相比具有显著性差异（P＜0.05），具备良好的发酵能力。
图5 风味米曲的半固态发酵结果
Fig.5 Semi-solid fermentation results of flavor rice starter
不同字母表示同指标差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 风味米曲的半固态发酵制备米香型白酒验证
选择了不同产区的优质小曲样品A、B、C作为对照，进行实际酿造，研究了最优拟合工艺下制备出的风味米曲的酿造效果，结果见图6。
图6 风味米曲的半固态发酵验证试验结果
Fig.6 Verification tests results of semi-solid fermentation results of flavor-producing rice starter
由图6可知，4种酒曲的酿造效果具有明显差异。其中风味米曲的总酯含量与其余3种小曲具有显著性差异（P＜0.05），产量最高，达到了6.87 g/L；此外总酸含量、感官评分值分别为1.63 g/L、92分，同样与其余酒曲具有显著性差异，均为最优。产香酵母的添加，使得风味米曲的产酯能力与产酸能力明显提升，这对酒体感官品质起到了很大的贡献作用，极大的改善了米香型白酒香气。为优质米曲的工业化生产提供了参考。
3 结论
用3株产香酵母与1株酿酒酵母制备复配酵母种，与纯种米根霉菌共培养制备风味米曲，以试饭感官评价分值、试饭酯含量、试饭乙醇含量为评价指标，针对酵母接种比例、培养温度、培养时间进行单因素试验。在此基础上，以米曲的试饭酯含量为响应指标，采用响应面法优化了制曲工艺，建立了风味米曲制作工艺的二次项回归模型，拟合出的理论最优工艺为酵母接种量1.0%，培养时间73 h，培养温度30 ℃。在此优化制备工艺条件下，试饭的酯含量为3.65 g/L。
风味米曲的质量指标检测与半固态发酵酿酒实验结果显示，风味米曲水分含量为10.58%，糖化力为423.77 U/g，发酵力为2.24 g/（g·72 h）。经半固态法实际酿酒后，酒体总酯含量达到了6.87 g/L，总酸与感官评分分别为1.63 g/L、92分，具备米香型白酒典型风格，且风味明显提升。利用产香酵母制备风味米曲，对米香型白酒起到了明显的增香作用。
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