随着人们对新型天然生物保鲜剂需求的增加，苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）因其具有宽广的抑菌谱，能抑制多种食源性致病菌（包括引起食品腐败的大部分细菌和真菌），且其溶解性好、对酸碱和热稳定性强，成为了人们研究的热点[1-5]。此外，苯乳酸近年还被发现作为新型生物相容性的单体，用于工业和医药领域合成重要的药物[6-7]。然而目前苯乳酸发酵水平明显不能满足市场的需求，通过菌种改造、培养基优化、工艺优化等手段来提高产量是苯乳酸发酵研究的重点。
自1998年DIEULEVEUX V等[8-9]确定苯乳酸是白地霉（Geotrichum candidum）产生的主要抑菌物质以来，人们在苯乳酸发酵产量的提高方面做了大量的研究。杨小院等[10-11]研究发现，微胶囊化细胞和添加外源4,5-二羟基-2,3-戊二酮可增加自诱导子AI-2的表达及提高群体感应（quorum sensing，QS）能力，有利于提高苯乳酸的产量，并通过对发酵条件优化提高苯乳酸的产量。李兴峰等[12-13]利用泡菜中筛选得到的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SK007，并优化了补料发酵、静息细胞和渗透化细胞转化等工艺。李芬等[14-15]通过对植物乳杆菌LY-78进行诱变、培养基和发酵条件优化来提高苯乳酸产量。ZHENGZ J等[16]将筛选得到嗜热苯乳酸生产菌Bacillus coagulans SDM，在50 ℃条件下利用全细胞转化合成苯丙氨酸。另有一些学者通过构建重组基因工程菌的方法来提高苯乳酸的生产能力，ZHU Y B等[17]利用一些小的疏水基团替代戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）中D-乳酸脱氢酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）的Tyr52基团，并通过全细胞催化在Escherichia coli BL21中过表达来提高苯乳酸的产量。
本研究从不同的环境中采用改良的菌种筛选方法分离得到2株苯乳酸高产菌株[18]，为进一步提高苯乳酸发酵产量，采用响应面法[19]（response surface method，RSM）对植物乳杆菌（L.plantarum）BLPC002发酵培养基进行优化，旨在为后续苯乳酸发酵放大试验提供思路和基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002：本实验室筛选保藏。
1.1.2 试剂
培养基各组分：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯乳酸、苯丙氨酸标准品（纯度98%）：美国SIGMA公司；甲醇、三氟乙酸（均为色谱纯）：德国MERCK公司。
1.1.3 培养基
保藏培养基（MRS琼脂培养基）：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸钠5.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，吐温80 1.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，琼脂20.0 g/L，蒸馏水1.0 L，pH6.2，121 ℃灭菌20 min。
发酵培养基：苯丙氨酸4.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸钠5.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·7H2O 0.25 g/L，吐温80 1.0 g/L，蒸馏水1.0 L，pH6.2，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
e2695 Alliance 高效液相色谱仪：美国Waters公司；SW-CJ-2FD双人净化工作台：苏州净化设备有限公司；ZWY-2102C恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；NCMY40超纯水机：重庆隆暾科技有限公司；Biostat A全自动发酵罐：德国赛多利斯集团。
1.3 方法
1.3.1 发酵液中苯乳酸的检测方法
发酵液经10 000 r/min离心5 min和0.22 μm滤膜过滤后，采用Waters e2695 Alliance 高效液相色谱分离单元和Waters 2489 UV/Vis检测器进行分析。参考黄国昌等[20]的方法，色谱柱：Waters Symmetry® C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：30 ℃，进样量：10.0 μL，流速：1.0 mL/min，流动相：A相为0.05%三氟乙酸甲醇溶液（V/V），B相为0.05%三氟乙酸溶液（V/V），洗脱程序：0～20 min为A∶B由10%线性变化为100%，20～23 min为100%A相，23～25 min保持A∶B为10%，检测波长：210 nm。
1.3.2 培养方法
种子培养：取斜面保藏菌种1环接入灭菌后的MRS培养基中，装液量为200 mL/500 mL，30 ℃、100 r/min摇床培养24h，备用。
发酵培养：以3%的接种量吸取种子液接入灭菌后的发酵培养基中，摇瓶装液量为30 mL/100 mL，30 ℃、100 r/min摇床厌氧培养48 h。
1.3.3 单因素试验
（1）氮源优化单因素试验：以改良MRS培养基为基础，在添加苯丙氨酸的情况下，每组试验分别缺少一种氮源，进行单因素试验，考察牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉对苯乳酸产量的影响。另外，在其他组成不变的情况下，考察了作为底物的苯丙氨酸、牛肉浸粉及酵母浸粉添加量对苯乳酸产量的影响。
（2）碳源优化单因素试验：分别以20.0 g/L添加量的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和麦芽糖为唯一碳源，加入改良MRS培养基其他成分及苯丙氨酸，考察不同碳源对苯乳酸产量的影响。另外，在其他组成不变的情况下，单独考察了最佳碳源添加量对苯乳酸产量的影响。
（3）其他因子单因素试验：以MRS培养基为基础，在添加苯丙氨酸的情况下，分别缺少磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸镁、醋酸钠和吐温80中的一种因子进行单因素试验，考察各因子对苯乳酸产量的影响。
1.3.4 Plackett-Burman试验
在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.7软件选择Plackett-Burman（PB）试验设计从苯丙氨酸、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸锰、吐温80中筛选出对苯乳酸产量影响显著的因素。每个因素选取高低2个水平，高水平约为低水平值的1.5倍，每组3个平行试验，培养48 h后检测发酵液中苯乳酸含量（Y）。PB试验因素及水平见表1。
表1 发酵培养基配方优化Plackett-Burman试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for fermentation medium formula optimization
1.3.5 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验结果，对影响显著的因素设定合适的步长和变化方向，正效应因素水平增加，负效应因素水平降低，使影响显著因素水平快速经济逼近最佳区域，为下一步响应面优化试验确定中心点。
1.3.6 Box-Behnken响应面优化试验
以最陡爬坡试验苯乳酸产量最高组对应的显著影响因素水平为中心点，采用Box-Behnken（BB）试验设计方法，以苯乳酸产量（Y）为响应指标，进行3水平试验，确定各影响因素的最佳水平，得到最优培养基组成。BB试验因素水平及其编码见表2。
表2 发酵培养基配方优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation medium formula optimization
1.3.7 统计分析
运用Design Expect 8.0.7软件对回归模型进行方差分析和可靠性分析，并对最大响应值及各因素的最佳编码值进行预测和验证试验，得出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002产苯乳酸的最佳培养组成。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同氮源对苯乳酸产量的影响
以改良MRS培养基为基础，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每组试验分别缺少一种氮源，并以改良MRS培养基+4.0 g/L苯丙氨酸作为对照，每组试验重复3次，配比及试验结果见表3。由表3可知，缺少蛋白胨的试验组与对照组苯乳酸产量几乎相同；在不添加牛肉浸粉的情况下，苯乳酸产量有所提高；而缺少酵母浸粉时的苯乳酸产量最低，由此初步判断，蛋白胨对苯乳酸的代谢过程无明显影响，而牛肉浸粉和酵母浸粉对苯乳酸产量均存在影响，作为下一步筛选苯乳酸产量主要影响的因素。
表3 不同氮源对苯乳酸产量的影响
Table 3 Effect of different nitrogen sources on the yield of phenyllactic acid
进一步对牛肉浸粉、酵母浸粉和苯丙氨酸添加量对苯乳酸产量的影响进行了研究，结果见图1。由图1可知，当牛肉浸粉添加量为3.0 g/L时，苯乳酸产量最高，随着牛肉浸粉添加量增加，苯乳酸产量出现下降趋势；随着酵母浸粉添加量逐渐增加，苯乳酸产量有所增加，当酵母浸粉添加量达到3.0 g/L以上时，苯乳酸产量无明显变化；苯丙氨酸添加量＜4.0 g/L时，苯乳酸产量呈增加趋势，在4.0～5.0 g/L时，呈缓慢增加，随后呈缓慢下降趋势。进行Plackett-Burman试验时，选择牛肉浸粉3.0 g/L为低水平，选择酵母浸粉3.0 g/L为高水平，选择苯丙氨酸4.0 g/L为低水平。
图1 不同氮源添加量对苯乳酸产量的影响
Fig.1 Effect of different nitrogen sources addition on the yield of phenyllactic acid
2.1.2 不同碳源对苯乳酸产量的影响
不同碳源及最适碳源添加量对苯乳酸产量的影响如图2、图3所示。由图2可知，以葡萄糖为唯一碳源时，苯乳酸产量最高，约为其他碳源的2倍以上，因此选择葡萄糖作为植物乳杆菌BLPC002发酵苯乳酸的碳源。由图3可知，当葡萄糖添加量＜20.0 g/L时，随着葡萄糖的增加，苯乳酸产量增加明显，当葡萄糖添加量＞20.0 g/L时，苯乳酸产量增长缓慢。故选择葡萄糖添加量20.0 g/L为低水平进行Plackett-Burman试验。
图2 不同碳源对苯乳酸产量的影响
Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of phenyllactic acid
图3 葡萄糖添加量对苯乳酸产量的影响
Fig.3 Effect of glucose addition on the yield of phenyllactic acid
2.1.3 其他因子对苯乳酸产量的影响
考察了磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、酸酸钠、硫酸锰、硫酸镁和吐温80对苯乳酸产量的影响，以改良MRS培养基为基础，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每组试验分别缺少其中一个因素，并以改良MRS培养基+4.0 g/L苯丙氨酸作为对照，每组试验做3个平行试验，结果取平均值，试验方案及结果如表3所示。由表3可知，柠檬酸氢二铵、醋酸钠和硫酸镁对苯乳酸的产量没有明显的影响，且与对照组接近，而磷酸氢二钾、硫酸锰和吐温80对苯乳酸的产量产生了较明显的影响，因此将磷酸氢二钾、硫酸锰和吐温80作为下一步筛选影响苯乳酸产量的因子。
表4 其他因子对苯乳酸产量的影响
Table 4 Effect of other factors on the yield of phenyllactic acid
磷酸氢二钾、硫酸锰和吐温80的添加量对苯乳酸产量的影响见图4。由图4可知，磷酸氢二钾添加量2.0 g/L时苯乳酸产量最高，硫酸锰添加量0.2～0.3 g/L时苯乳酸产量接近最大，吐温80添加量1.0～1.5 mL/L时苯乳酸产量最高，故选择添加量分别为磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸锰0.25 g/L、吐温80 1.5 mL/L为高水平进行Plackett-Burman试验。
图4 磷酸氢二钾、硫酸锰、吐温80添加量对苯乳酸产量的影响
Fig.4 Effect of K2HPO4,MnSO2 and tween 80 addition on the yield of phenyllactic acid
2.2 苯乳酸产量显著影响因子的筛选
Plackett-Burman试验结果见表5。利用DesignExpert 8.0.7软件对表3的试验结果进行回归性分析，得到各因素的偏回归系数和影响显著性见表6。由表5、表6可知，苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量对苯乳酸产量影响显著，其中苯丙氨酸和葡萄糖为正效应，牛肉浸粉为负效应，作为下一步进行爬坡试验的依据。
表5 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments
表6 Plackett-Burman试验设计影响因素显著性及效应分析
Table 6 Significance and effect analysis of influence factors in Plackett-Burman experimental design
2.3 最陡爬坡试验结果
表7 最陡爬坡试验设计及结果
Table 7 Design and results of the steepest ascent experiments
根据Plackett-Burman试验分析的结果，选取苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖3个因素进行最陡爬坡试验，苯丙氨酸和葡萄糖为正方向，爬坡起点分别为6.0 g/L和20 g/L，步长分别为1.0 g/L和5.0 g/L，牛肉浸粉为负方向，爬坡起点为3.0 g/L，步长为0.5 g/L。其他因子根据影响贡献率大小，分别选取高低水平。试验设计及结果见表7。由表7可知，随着苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量的变化，苯乳酸产量先升后降，当三者添加量分别为8.0 g/L、2.0 g/L和30.0 g/L时，苯乳酸产量最高，达到1.322 g/L，以此添加量作为中心点，进行下一步优化试验。
2.4 Box-Behnken试验设计及培养基组成优化结果
以最陡爬坡试验结果为依据，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，试验结果如表8所示。试验数据用Design Expect 8.0.7软件进行回归分析后，拟合得到以下回归方程：
表8 Box-Behnken试验设计及结果
Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments
运用Design Expect 8.0.7软件对回归模型进行方差分析，结果见表9。由表9可知，A、B、AB、BC、A2、B2和C2项的P值都小于0.05，其对结果有极显著或显著影响，且模型F值为32.71、P值为0.000 6＜0.05，表明回归模型是显著的，失拟项F值为3.25，P值为0.244 1＞0.05，表明模型失拟项不显著，因此，回归模型是高度显著的，各试验因子对响应值的影响呈二次抛物面关系。该模型Mean（响应值）=1.567，即苯乳酸产量的均数为1.567 g/L，R2（相关性决定系数）=98.33%，即由苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖及其二次项所确立的模型能解释苯乳酸产量变化的98.33%，R2Adj（校正相关性决定系数）=95.32%，表明该模型的预测值和实测值拟合良好，可以很好地解释响应值的变化情况，回归方程给该菌株发酵生产苯乳酸提供了一个合适的模型。
表9 回归模型方差分析
Table 9 Variance analysis of the regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
根据回归分析的结果，运用Design Expert 8软件作出模型的响应曲面图和等高线图，如图5所示，三维响应曲面图和二维等高线图是回归方程的图形解释形式，可以直观地显示各因素之间的相互作用和最大响应值对应的各因素最佳水平，曲面越明显表示响应值在试验设计水平范围内存在极值，变量对应的水平为等高线最小椭圆的中心点，等高线表示因素间的交互作用及影响的显著性，等高线图呈明显的椭圆形表示因素间的交互作用明显，等值线密度越大，表示该因素影响越显著。
图5 各因素交互作用对苯乳酸产量响应的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of phenyllactic acid
2.5 最佳培养基成分的预测
通过对回归方程各自变量求极值，得到回归模型预测的最佳编码值为A=0.147 5，B=-0.167 5，C=-0.0095，即苯丙氨酸8.295 g/L，牛肉浸粉1.832 5 g/L，葡萄糖29.952 5 g/L。此时，苯乳酸产量最大预测值为1.674 1 g/L。考虑到实际操作需要，确定最佳培养基添加量分别为苯丙氨酸8.3 g/L，牛肉浸粉1.8 g/L，葡萄糖30.0 g/L。在此条件下苯乳酸产量为1.67 g/L。
2.6 验证试验
为验证模型的可靠性和预测最大值，用上述最佳培养基配方进行5次平行验证试验，苯乳酸平均产量为1.67 g/L，与预测值非常接近，说明该模型能准确反映各因素的变化与PLA产量之间的关系，该模型的设计具有可靠性。
3 结论
通过对植物乳杆菌BLPC002发酵培养基优化后，苯乳酸产量达到1.67 g/L，比优化前的0.358 g/L提高了4.6倍；通过单因素试验、响应面法试验设计及回归模型方差分析，筛选出了对苯乳酸产量具有显著影响的3个因素，分别为苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖，确定了三者最佳添加量分别为8.3 g/L、1.8 g/L、30.0 g/L，苯乳酸产量为1.67 g/L，并通过验证试验，苯乳酸产量与预测值非常接近，表明该模型的设计具有可靠性。
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