蜂蜜是昆虫蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜，其主要成分为单糖（葡萄糖、果糖）（占总糖的85%～95%），还含有丰富的酶、矿质元素、维生素、氨基酸等[1-2]，稀释的蜂蜜经酵母菌发酵可制成具有保健作用的蜂蜜酒[3-5]。蜂蜜酒需要较长时间发酵，可能在最终产品中引入令人不快的气味[6-7]。蜂蜜酒的发酵过程若蜜汁的浓度过低，酵母菌会因碳源不足衰老自溶[8]，而高浓度的蜜汁有较高的渗透压，要求用于发酵的酵母需适应蜂蜜的抑菌和高渗环境。目前国内售的蜂蜜酒多为蜂蜜与酒勾兑而成，缺乏适用于蜂蜜酒发酵的菌株，筛选合适的菌株成为蜂蜜酒研制的关键问题。通常从高糖环境中筛选耐高糖酵母[9]，研究表明原生的蜂蜜中含有耐高渗酵母菌及其他微生物[10-13]，但鲜见从蜂蜜中分离菌株发酵蜂蜜酒的报道。云南野生蜂蜜资源丰富，本研究从云南文山的蜂蜜样品中分离酵母菌，通过形态学鉴定和基因间隔序列（internal transcript space，ITS）分析进行菌种鉴定，经过感官评价筛选性能较优的酵母，并将其应用于蜂蜜酒研制，采用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）-气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法对发酵液进行挥发性成分分析[14-15]，旨在为蜂蜜酒的开发提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品采集
采自云南文山的12份蜂蜜样品（编号1～12号）。
1.1.2 试剂
真菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；FTC-3000P型聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：加拿大Funglyn Biotech公司；二氯甲烷、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉（均为分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）固体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂20 g/L，酵母膏10 g/L，pH 自然，121 ℃灭菌25min。
蜂蜜稀释液：蜂蜜与水按3∶7的体积比进行混合，75 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
ZHWT-2012 恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-250-G恒温干燥培养箱：广东省医疗器械厂；SW-CJ-2PD超净工作台：苏净安泰空气技术有限公司；YXQLS-100SII立式压力蒸汽灭菌器锅：上海博迅实业有限公司；THERMOFISHER（ISQ）气相色谱/质谱联用仪、TR-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管色谱柱：美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Scout SE电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；共同蒸馏萃取装置（定制）；HH-S2电热恒温水浴锅：江苏大地自动化仪器厂；GelDoc EZ型凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌的分离纯化
取1 g 蜂蜜样品，加入9 mL无菌生理盐水中，混匀后进行10倍梯度稀释，选取适宜的浓度梯度，用涂布法接种于YPD 固体培养基，32 ℃恒温培养箱倒置培养48 h，挑取具有典型酵母菌形态特征的菌落，平板划线纯化，直至获得纯培养菌株。挑取单菌落转接到YPD 斜面，于32 ℃恒温培养48 h，装入密封袋置于4 ℃冰箱保藏。
1.3.2 酵母菌的鉴定
（1）菌株的形态特征
采用划线法接种少量已纯化好的菌种于YPD平板上，28 ℃培养48 h，观察菌落干湿、隆起、颜色、菌落边缘、表面光泽、质地等形态特征，选取单个菌落制成装片光学显微镜高倍下观察记录细胞形态。
（2）聚合酶链式反应扩增和DNA 测序
以平板划线法对保存斜面菌种活化验纯，挑取单菌落接种于YPD试管斜面作为种子，将每只试管种子接种于装液量为150 mL/250 mL YPD液体培养基中，30 ℃培养5 d，再次验纯，培养物13 000 r/min 离心10 min，收集菌体。参照说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取高质量的菌体基因组DNA。采用酵母菌通用引物ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS4B：5'-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3'对5.8S rDNA-ITS序列进行扩增[16]。25μLPCR反应体系为：2×PowerTaq PCRMasterMix12.5μL，引物各2 μL，模板2 μL，加无酶水补足25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预热3 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃终延伸5 min，30 个循环后72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存[17]。切下500～750 bp左右的目标片段，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。PCR回收产物的测序工作由昆明硕擎测序公司完成。
1.3.3 ITS序列比对及系统发育树分析
从GeneBank中获取Z.siamensis、Z.mellis、Z.pseudorouxii、Z.rouxii和Z.sapae等菌株的ITS序列。在MEGA-X[18]中使用MUSCLE[19]进行多序列比对，并采用邻接（neighbour-joining，NJ）法[20]以1 000次bootstrap[21]推测系统发育树。
1.3.4 蜂蜜酒发酵酵母菌的筛选
将分离得到的菌株制备种子液，分别以5%的接种量接种到200 mL蜂蜜稀释液中，每个菌株接种3瓶。28 ℃静置培养30 d，制备蜂蜜酒。通过感官评价筛选出口感好、香味浓郁的发酵菌株。
1.3.5 蜂蜜酒挥发性成分分析
利用同时蒸馏萃取（SDE）-气质联用（GC-MS）法对蜂蜜酒样品中挥发性成分进行分析，量取300 mL蜂蜜酒样品置于500 mL样品瓶，加入2.0 g NaCl，电热套加热样品保持微沸，量取40 mL二氯甲烷置于溶剂瓶中，用60 ℃恒温水浴加热，蒸馏萃取2 h停止加热。萃取溶剂中加入适量无水硫酸钠静置密封，置于冰箱中冰冻过夜，0.45 μm滤头过滤后供GC-MS分析。
气相色谱条件为TR-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为氦气（He）；柱流量为0.5 mL/min；进样模式：分流模式（分流比为20∶1）。
程序升温：起始温度为40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min的速率升至100 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速率升温至230 ℃保持8 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，倍增器电压1 600 V。质谱扫描范围为10～500 amu，扫描方式：全扫描，扫描速度：0.2 scan/s。离子源温度为230 ℃，传输线温度：250 ℃。
定性定量分析：各组分通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11谱库检索进行定性分析，采用面积归一法进行定量分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离及形态特征
从第3、5、7、9和10号蜂蜜样品中分别分离到Y3、Y5、Y7、Y9和Y10等5株菌，其形态观察结果见表1。由表1可知，5株菌的细胞形态相似，均呈椭圆，菌株Y3、Y5、Y9和Y10菌落特征相似，菌株Y7菌落较为扁平，其菌落及细胞形态如图1所示，5株菌均呈现典型的酵母菌落特征，初步判定这5株菌为酵母菌。
表1 分离菌株菌落及细胞形态观察结果
Table 1 Colony and cell morphology of isolated strains
图1 菌株Y3的菌落（a）及细胞（b）形态特征
Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain Y3
2.2 分离菌株分子鉴定结果
2.2.1 分离菌株的PCR 结果
5株分离菌株的PCR 扩增结果见图2。由图2可知，5株菌的PCR产物片段大小在500～750 bp 之间，判断为5株酵母菌的ITS序列扩增产物。
图2 分离菌株PCR扩增的结果
Fig.2 PCR amplification results of isolated strains
2.2.2 分离菌株的分子生物学鉴定结果
分离菌株5.8S rDNA-ITS序列相似性基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）查询结果如表2所示，菌株Y3、Y5、Y9和Y10与菌株Zygosaccharomyces siamensis AB565769.1相似性在99%以上，菌株Y7与菌株Zygosaccharomyces siamensis AB565768.1相似性在99%以上。
表2 酵母5.8S rDNA-ITS序列相似性Blast查询结果
Table 2 Blast search results of 5.8S rDNA-ITS sequence similarity of isolated strains
分离菌株的ITS序列比对后，在MEGA-X中以邻接法构建系统发育树，结果见图3。由图3可知，菌株Y3、Y5、Y9和Y10与Zygosaccharomyces siamensis AB565769.1聚为一簇，Y7与Zygosaccharomyces siamensis AB565768.1聚为一簇。初步鉴定5株酵母菌均为暹罗接合酵母（Zygosaccharomyces siamensis）。
图3 分离菌株基于ITS基因序列的系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on ITS gene sequences
2.3 蜂蜜酒发酵酵母菌的筛选
以5株酵母菌发酵蜂蜜酒，其感官评价结果见表3。
表3 酵母菌发酵蜂蜜酒的感官评价
Table 3 Sensory evaluation of mead fermented with yeasts
由表3可知，发酵得到的蜂蜜酒都呈淡黄色，其中菌株Y7发酵的蜂蜜酒杂味较多，菌株Y3、Y5、Y9和Y10发酵蜂蜜酒的香型比较接近，都有独特果香，其中以菌株Y3发酵的蜂蜜酒酒香和果香最为浓郁，发酵过程产生二氧化碳气泡，入口微辣，口感清爽，菌株Y5、Y9和Y10的酒香和果香较淡，选择菌株Y3进行蜂蜜酒发酵进一步研究。
2.4 蜂蜜酒发酵样品挥发性成分分析
采用GC-MS对Y3发酵蜂蜜酒样品的挥发性成分进行分析，其总离子流色谱图见图4。
图4 蜂蜜酒样品挥发性成分GC-MS分析总离子流图
Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components in the mead sample analysis by GC-MS
经过NIST11谱库检索得到挥发性化合物的种类，计算相对含量结果见表4。由表4可知，样品共检出41种挥发性成分，其中酯类14种，醇类7种，酸类2种、醛酮4种、烷烃12种。醇类物质和酯类物质是发酵样品香气的主要成分，醇类组分有2-甲基丙醇、苯乙醇、异戊醇等。其中，2-苯乙醇和异戊醇的相对含量分别为58.11%和25.43%；异戊醇具香蕉香味，刺舌头，微涩。2-苯乙醇与玫瑰花香相似，微带苦涩感。酯类物质有4-羟基丁酸乙酰酯，3-甲基戊酸乙酯，乙酸戊酯，辛酸乙酯，这些酯类产生的香气相互综合，赋予发酵样品浓郁的酯香。此外，在发酵样品中检测到酸类、醛类，含量低，可能对发酵样品香气的直接贡献不大，但使发酵样品的香气更加饱满。
表4 蜂蜜酒样品挥发性成分GC-MS分析结果
Table 4 Results of volatile components in the mead sample analysis by GC-MS
续表
3 结论
本研究从12份云南文山蜂蜜样品中分离得到5株酵母菌，结合菌株形态学特征和分子生物学分析，鉴定5株酵母菌均为暹罗接合酵母（Zygosaccharomyces siamensis）。5株酵母菌都可发酵蜂蜜稀释液，其中菌株Y3发酵的蜂蜜酒酒香和果香最为浓郁。以SDE-GC/MS方法分析菌株Y3发酵蜂蜜酒，蜂蜜酒样品中含41种挥发性成分，2-苯乙醇和异戊醇相对含量达到58.11%和25.43%，是发酵液中主要的挥发性成分。实验结果为蜂蜜酒开发提供了菌株资源。
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