在中国，馒头成为人们的主食已经流传许久[1]，至今约有一千多年的时间。传统老酵子作为发酵剂制作的馒头一直受人们喜爱。老酵子是混合的发酵剂，里面含有大量的菌种，其中酵母菌起主要发酵作用，这些菌种能够在面团发酵时通过自身进行酯化反应等反应，使面团拥有独特的风味口感[2]。由于传统老酵子多来自于民间农家储存方法，其中不乏含有一些杂菌影响馒头的风味和口感[3]。因此，可将传统老酵子中分离出的菌株进行筛选，从而获得发酵性能较强、产香性能高的酵母菌株。
在以往关于酵子发酵产香的菌种的研究中，付娜等[4]对筛选出的酵母菌菌株进行分子鉴定和挥发性物质分析；党辉等[5]对从酵子馒头中分离得到的3株酵母的发酵性能分析；马榕灿等[6]对多种酵母的生长和对面团发酵特性差异进行研究。然而目前对分离筛选出产香性能高的酵母菌株应用于馒头生产工业中挥发性物质成分的差异分析鲜有相关报道。因此，本研究从传统老酵子中筛选出活性和产香较好的酵母菌，对其进行分子生物学鉴定和生长条件优化，利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法对添加产香酵母发酵馒头和未添加产香酵母馒头中挥发性物质进行定量定性分析，可作为提高工业生产馒头风味口感的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
传统老酵子：河南省南阳市市售；高筋小麦面粉：河南龙腾面粉有限公司；活性干酵母：广东梅山马利酵母食品有限公司。
1.1.2 化学试剂
蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、琼脂（均为生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；酵母基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、DL2000 DNA Marker：天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶：广东盛东科技有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京智杰方远有限公司；生物染色液试剂：福建海标有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：蛋白胨8 g，酵母提取物4 g，葡萄糖8 g，蒸馏水400 mL。
YPD固体培养基：向YPD液体培养基中加入8 g琼脂。将上述培养基放置在120 ℃灭菌25 min。
1.2 仪器与设备
HZQ-X10型恒温培养箱：绍兴市景迈仪器设备有限公司；ABI9700聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：康力生物科技有限公司；THZ-24空气浴恒温摇床：金坛区金城春兰实验仪器厂；XSP-8C型电子显微镜：上海精密仪器仪表有限公司；ZF-388型全自动凝胶成像分析仪：北京六一仪器厂；DYY-6C型电泳仪：河北联润设备有限公司；Implen OD600nm细菌/细胞浓度仪：北京盛科信德有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的分离纯化
称取0.3 g老酵子将其碾碎后，溶于无菌水中用灭菌玻璃棒搅匀20 min，使其基本溶解，加入200 mL YPD液体培养基中28 ℃、180 r/min培养24 h，取上述培养液的上清液2 mL将其稀释104～106倍后取60 μL均匀涂布于YPD固体培养基上，28 ℃恒温培养1～2 d，当平板上长出菌落时，挑取单菌落连续划线传代培养2～3次得到纯化菌株。将得到的纯菌株保菌，放于-80 ℃冰箱保存。
1.3.2 产香菌株筛选
初筛：取纯化后的菌株以2%的接种量接种于100 mL YPD液体培养基中，在28 ℃恒温180 r/min摇床培养1～2 d，同时将其划线接种于YPD固体培养基上在28 ℃条件下培养1～2 d，采用嗅闻法，参考王益姝[7]的方法，通过嗅闻发酵液和固体平板产生的独特风味，初筛选出产生独特香气的酵母菌。
复筛：取上述通过初筛得到的酵母菌的发酵液10 mL于100mL锥形瓶中，再加入10mL蒸馏水，滴加酚酞，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至显色后，转移到10 mL0.1 mol/LNaOH溶液的圆底烧瓶中，水浴加热皂化回流，取下冷却至室温用0.1 mol/L HCl标准溶液滴定至红色消失，记录HCl消耗的体积，每株菌发酵液3次平行测定取均值，计算发酵液的总酯含量[8]。筛选出一株总酯含量较高的菌株。
1.3.3 分子生物学鉴定
使用试剂盒提取菌株的DNA，利用真菌通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCT-3'）和NS8（5'-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3'）对18S rDNA序列进行扩增。再设置程序95 ℃保持4 min预变性，95 ℃保持30 s变性，55 ℃退火50 s，70 ℃延伸40 s，72 ℃延伸10 min，循环次数为30次进行扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离。将PCR扩增产物样品委托北京天一辉远生物有限公司进行DNA一代测序检测。将菌株的测序结果进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对分析，从GenBank数据库中搜索选取同源性相似的序列，使用MEGA 7软件建立酵母菌的系统发育树。
1.3.4 酵母菌生长曲线的测定
将菌株ZT-01以1%的接种量接种到10 mL YPD液体培养基试管中，28 ℃、180 r/min摇床中培育48 h，设定在波长600 nm处每隔4 h测定样品的吸光度值（OD600nm值），3次平行取均值，用Origin 2020软件作图。
1.3.5 最适生长温度及最适生长pH的测定
将菌株ZT-01发酵液以1%接种量接种到10 mL YPD液体培养基试管中，调培养基的pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5，于24 ℃、26 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃条件下180 r/min恒温振荡培养28 h，在波长600 nm处分别测定OD600nm值。
1.3.6 馒头制作
添加产香酵母馒头制备：称取0.3 g活性干酵母将其加入100 mL无菌水中搅拌均匀，取筛选得到的一株产香酵母以2%的接入量添加到活性干酵母溶液中，搅拌均匀后倒入称好的面粉中（面粉和水比例2∶1），放入和面机中和面成型，放入恒温恒湿箱中醒发2 h左右（温度35 ℃，相对湿度80%）。直到成型的馒头体积膨大为原来的1倍左右。放入蒸锅中蒸熟后取出。未添加产香酵母馒头制备方法同上。
1.3.7 香气成分GC-MS 分析
酵母馒头香气成分GC-MS分析。顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction gas chromatography，HS-SPME）条件：取5 g样品放入固相微萃取样品瓶中，萃取温度为85 ℃，转速为600 r/min，萃取时间为40 min，再放入气相色谱进样口解吸6 min（温度200 ℃）。
气相色谱条件：色谱柱为HP-5（30 m×0.53 mm×5 μm）；载气为高纯氦气（He）（纯度＞99.999%），柱温50 ℃，保持时间10 min，以2 ℃/min速度持续加热升温直至250 ℃，保持20 min。质谱条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；扫描范围50～800 m/z。根据所得GC-MS总离子流图上的峰值，检索美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）-08数据库得到其对应的物质，计算出各种香气成分的相对含量（%）。
2 结果与分析
2.1 产香酵母菌的初筛
由表1可知，从老酵子中筛选出5株产香酵母菌株，分别编号为ZY-01、ZY-02、ZY-03、ZY-04、ZY-05，5株菌株呈现不同的菌落数量、产香强度和风味特征，菌株ZY-01、ZY-02液体培养和固体培养产生较浓烈的酯香和酒香，菌落数量生长数量较多，说明菌株ZY-01和ZY-02的生长活性较高且产香性能较好。菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05液体培养和固体培养具有淡淡的果香和酯香其风味较弱，菌落数量生长数量较少，说明菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05的生长活性较低且产香性能较差。
表1 筛选菌株初筛结果
Table 1 Primary screening results of screened strains
注：“+”表示菌落数量和发酵香味强度，“+”越多表示菌落数越多、发酵香味强度越强。
2.2 产香酵母菌的复筛
由图1可知，5株菌株的总酯含量高低不同，其中菌株ZY-01的发酵液中总酯含量最高为355.2 mg/L。综合初筛和复筛结果，选择菌株ZY-01作为产香菌株进一步研究。
图1 筛选菌株复筛结果
Fig.1 Secondary screening results of screened strains
2.3 菌株ZY-01形态观察
菌株ZY-01菌落及细胞形态观察结果见图2。由图2A可知，在YPD固体培养基上的菌落的体形态特征大多为白色圆型，质地均匀，菌落表面光滑呈不透明状，粘稠并散发出发酵的香气。由图2B可知，涂片滴加结晶紫染色剂染色细胞，在100×显微镜下观察，酵母细胞为紫色多呈椭圆形。
图2 菌株ZY-01的菌落形态（A）和细胞形态（B）
Fig.2 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain ZY-01
2.4 菌株ZY-01分子生物学鉴定
2.4.1 酵母菌的PCR扩增结果
将选取的菌株ZY-01进一步使用分子生物学方法进行鉴定，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，结果见图3。由图3可知，菌株ZY-01 PCR扩增产物在500～750 bp之间有一条清晰的亮带，从而得到了菌株ZY-01的18S rDNA碱基长度。
图3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product
1泳道为菌株ZY-01；M泳道为M-DL2000 Marker。
2.4.2 序列分析结果
菌株ZY-01 18S rDNA系统发育进树结果见图4。由图4可知，菌株ZY-01与NCBI同源序列对比结果可知Wickerhamomyces anomalus strain DBF29（KT207259.1）的亲缘关系最近，序列的相似度达到99%。结合图3结果，菌株ZY-01被鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。
图4 菌株ZY-01基于18S rDNA序列PCR扩增产物的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZY-01 based on 18S rDNA sequence PCR amplification products
2.5 菌株ZY-01生长特性分析
2.5.1 菌株ZY-01的生长曲线的测定
图5 菌株ZY-01生长曲线
Fig.5 Growth curve of strain ZY-01
由图5可知，菌株在0～8 h为迟缓期，生长缓慢且时间较短；经过迟缓期后，12～28 h为对数生长期，此时期时间较长，菌株生长速率最大，代谢速率最旺盛；在28 h时OD600nm值上升至1.75，此时达到最大，菌株在28～48 h为稳定期，在这期间随时间的不断延长OD600nm值基本保持大致稳定，稳定期内菌株ZY-01 OD600nm值基本都在1.70～1.75。
2.5.2 菌株ZY-01的最适生长温度及最适pH的测定
图6 温度（A）及pH值（B）对菌株ZY-01生长的影响
Fig.6 Effect of temperature (A) and pH value (B) on strain ZY-01 growth
由图6A可知，在不同温度条件下菌株ZY-01的生物量变化呈现先上升后下降的趋势。在24～28 ℃时，菌株ZY-01生物量持续上升，并在温度为28 ℃时达到最高，OD600nm值为1.82；温度在28～36 ℃时，菌株ZY-01生长受到了明显抑制；当温度＞36 ℃之后，酵母菌的生物量急剧下降，这是由于随着的温度升高，菌体出现了自溶现象致使酵母菌生长量减少[9-10]。因此，菌株ZY-01最适温度为28 ℃。
由图6B可知，在不同pH条件下OD600nm的生物量呈现出先上升后平缓的趋势。当pH值为3.0～4.0时，菌株ZY-01的OD600nm值迅速增加；当pH值为4.0～7.5时，菌株ZY-01的生长稳定，说明菌株ZY-01在pH值为4.0～7.5范围内生长良好。因此，菌株ZY-01的最适pH值为4.0。
2.6 产香酵母应用于发酵馒头研究
采用GC-MS法分析添加产香酵母发酵馒头和未添加产香酵母发酵馒头中的风味物质的种类和相对物质含量分析结果比较见表2。
表2 两种馒头主要风味物质种类和含量GC-MS分析比较
Table 2 Comparison of main flavor substance types and contents in two kinds of Mantou analysis by GC-MS
注：“-”表示未检出。
由表2可知，添加产香酵母发酵馒头中主要检测出物质含量较高的风味物质16种，未添加产香酵母发酵馒头中主要检测出物质含量较高的风味物质12种，其中两者共同检测出12种风味物质，最主要的成分为醇类、酯类、酸类、醛类和酮类化合物，添加产香酵母发酵馒头中含有醇类6种，酯类5种，酸类2种，醛类1种，酮类2种，未添加产香酵母发酵馒头含有醇类5种，酯类3种，酸类2种，醛类1种，酮类1种。添加产香酵母发酵馒头相比未添加产香酵母发酵馒头：醇类增加11.27%，酯类增加8.85%，酸类减少10.87%，醛类增加1.03%，酮类增加1.16%。添加产香酵母发酵馒头中醇类和酯类物质的种类和物质含量相比未添加产香酵母馒头物质含量显著增加（P＜0.05），醛类和酮类物质种类和物质含量增加差异不显著（P＞0.05），酸类物质含量显著减少（P＜0.05）。
由表2可知，添加产香酵母发酵馒头和未添加产香酵母馒头发酵产生的主要香气成分物质有乙醇、异戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛和4-羟基-2-环戊烯-1-酮。添加产香酵母发酵馒头相比于未添加产香酵母馒头以上物质含量增幅均有较大变化。由此可得出，产香酵母菌对馒头的风味物质产生了显著且有利的影响。乙醇具有酒香味和刺激性气味，苯乙醇具有清新的花香味，可作为食用香精，丙三醇又称作甘油，该物质具有暖甜味可作为甜味剂和保湿物质。糠醇具有香味可用作食品用香料。乙酸乙酯有甘甜的酒味和水果的清香。γ-丁内酯都具有特殊的芳香气味。乙酸苯乙酯具有花粉的蜂蜜香气和苹果样的果香[11]。苯乙醛具有水仙花香气，低浓度时具有樱桃香味[3]。4-羟基-2-环戊烯-1-酮有糖浆味和焦甜味。除此之外只在添加产香酵母发酵馒头中检测到而未添加产香酵母馒头没有检测到的4种香气物质分别为1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸异戊酯和苯乙酮。1-辛烯-3-醇有玫瑰花香味和清甜的甘草味[12]。辛酸乙酯具有香甜酒类香气可作为食品添加剂香料[13-16]。丁酸异戊酯具有强烈的香蕉香气味[17]。苯乙酮具有山楂的香气[18]。醇类阈值较高，在馒头中含量较高是馒头风味组成的重要成分。酯类、醛类和酮类阈值较低[19-20]，虽然在馒头中含量较低也能使馒头具有较强香气。添加产香酵母发酵馒头相比未添加产香酵母发酵馒头增加了香气物质种类和含量，这些香气赋予了馒头独特的香气且对风味的贡献较大。这也是添加产香酵母发酵馒头风味口感优于未添加产香酵母发酵馒头的重要因素。
3 结论
通过从传统老酵子中分离出的ZY-01菌株进行分子生物学鉴定和生长特性研究，结果表明，经鉴定ZY-01菌株为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。菌株ZY-01发酵液的最优生长条件：生长时间为28 h，温度为28 ℃，pH值为4.0。经GC-MS分析对添加产香酵母发酵馒头和未添加产香酵母发酵馒头中挥发性成分种类和含量进行检测，结果表明，两者发酵液的挥发性物质中共同的主要香气成分物质有乙醇、异戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁内酯、苯乙醛和4-羟基-2-环戊烯-1-酮，除此之外只在产香酵母发酵馒头中检测到1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸异戊酯和苯乙酮这4种香气物质。添加产香酵母发酵的馒头与未添加产香酵母发酵馒头相比醇类、酯类物质含量分别增加11.27%、8.85%。这些香气赋予了馒头独特的风味口感，这也是添加产香酵母发酵馒头风味口感优于未添加产香酵母发酵的馒头的重要因素。
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