食醋是我国饮食生活中必不可少的一种酸性调味品[1]，它的发明、发展和传播是对人类饮食文化的一大贡献[2]。在中国有“四大名醋”的说法，即四川麸醋、镇江香醋、山西老陈醋以及福建红曲醋[3]。作为四大名醋之一的四川麸醋，其主要特点是以麦麸为酿造主要原料，药曲为糖化发酵剂，采用糖化、酒化、醋化同池进行的生料固态开放式天然多菌种混合发酵工艺，发酵结束后其醋醅需要经过2～3年时间的晒制[4]，其风味及功能性物质的形成主要是通过各种微生物的代谢作用共同实现的，在发酵过程中微生物将原料中的淀粉、蛋白质等物质降解为还原糖、氨基酸等，同时还分泌大量的挥发性物质（醇类、酯类、醛类、酮类等）、有机酸（乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸等）和功能性物质（川穹嗪、黄酮等）等[5]。这些物质的共同存在赋予了四川麸醋特有的风味和良好的保健功能。由于四川麸醋酿造生产完全依赖于自然接种和发酵，因此存在生产周期长、产品质量不稳定以及产量低等问题，要进行有效的生产控制和工艺改造，就必须对现行传统工艺进行分析研究[6]。
食醋中有机酸的种类与含量既决定着其酸味质量，又与产品特色密切相关[1]。有机酸是构成食醋风味的主要成分，影响着食醋的滋味、口感，因此对食醋中有机酸的组成与含量的分析有利于评价食醋品质[7-8]。
目前，关于四川麸醋的研究多为功能菌株的筛选及产品风味物质的分析，对于发酵过程中理化指标及有机酸变化规律的系统研究鲜有报道，本研究对四川某麸醋酿造厂的醋醅跟踪采样，研究其发酵过程中水分含量、pH值、总酸、挥发酸、不挥发酸、氨基酸态氮、还原糖、淀粉含量等理化指标和有机酸组成与含量的变化规律，以期对生产控制和工艺改造提供较为系统的实验研究数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
麸醋醋醅样品均采集自四川某著名传统麸醋厂，该厂生产的麸醋是采用最传统的麸醋酿造方式发酵，是传统四川麸醋生产的典型代表。本实验随机选取3个发酵正常的池子进行取样，分别取发酵0、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d共6个阶段的醋醅样品，-20 ℃保存。
1.1.2 试剂
石油醚、无水乙醇、盐酸、乙酸铅、硫酸钠、葡萄糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、磷酸、（NH4）2HPO4、甲醛、NaOH、硫酸锌、亚甲基蓝（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：成都市科龙化工试剂厂；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乳酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、草酸、富马酸、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸标准品（纯度＞98%）：天津市光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
CP214电子天平、Starter 2C pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；TW-2000W可控调温电炉：成都市永信电器厂；DZTW电子调温电热套：北京市永光明医疗仪器有限公司；78HW-1恒温磁力搅拌器：金坛市医疗仪器厂；Agilent 1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦公司；Gemini 5u C18 110A色谱柱（250 nm×4.6 mm）：美国菲罗门公司；Sep-Pak C18 Cartridge固相萃取小柱：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 麸醋发酵过程中醋醅理化指标的测定
水分含量[1]：准确称取2.0 g醋醅样品于称量皿中，105 ℃恒温烘干至恒质量，称质量并计算醋醅中的水分含量。
pH值[5]：称取100 g醋醅样品于500 mL烧杯中，加入300 mL蒸馏水，并用保鲜膜将烧杯口封住，浸泡3 h，期间不断摇动，保证酸充分溶解于水中。而后用双层滤纸过滤，滤液待用。采用pH计直接测定滤液的pH值。
总酸含量[9]：取滤液按照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》中电位滴定法测定。先计算出滤液的总酸含量，再转化成干醅的总酸含量。
不挥发酸含量（以乳酸计）[10]：取滤液按照GB 18187—2000《酿造食醋》测定。不挥发酸含量计算公式如下：
挥发酸含量（以乙酸计）[6，11]=总酸-不挥发酸×0.06/0.09。
氨基酸态氮含量[12]：取滤液按照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中甲醛值法测定。
还原糖含量[13]：参照GB/T 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法（斐林试剂法）测定。
淀粉含量[14]：参照GB/T 5009.9—2016《食品安全国家标准食品中淀粉的测定》中的酸水解法测定。
1.3.2 麸醋发酵过程中醋醅有机酸组成分析
醋醅样品预处理：称取30.0 g醋醅样品于250 mL烧杯中，加90 mL超纯水，用保鲜膜将烧杯口封住，浸泡3 h，期间不断摇动。用双层滤纸过滤，滤液待用。吸取25 mL滤液于100 mL容量瓶中，加入5 mL 30%硫酸锌溶液和5 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液，摇匀，定容，静置30 min后双层滤纸过滤，用0.22 μm微孔滤膜过滤，再经Sep-Pak C18固相萃取小柱，流出液供HPLC检测[15-17]。
HPLC条件：Gemini5uC18110A色谱柱（250nm×4.6mm），以5%甲醇-95%0.5%（NH4）2HPO4（用H3PO4调节pH值为2.7）为流动相，流速0.5 mL/min，柱温35℃，紫外检测波长210 nm，进样量20 μL[17-18]。
定性定量：配制乙酸、富马酸、乳酸、苹果酸、草酸、丙酮酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸的混合标准溶液，其质量浓度分别为15.83 mg/mL、0.30 mg/mL、15.33 mg/mL、6.07 mg/mL、0.80mg/mL、1.28mg/mL、8.50mg/mL、4.00mg/mL、6.18mg/mL。分别取0、10 mL、12.5 mL、25 mL、50 mL的混合标准品溶液于100 mL容量瓶中，定容，混匀，得到不同质量浓度的标准品溶液。采用HPLC进行检测，以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。以保留时间和样品加标定性，再利用标准曲线回归方程计算样品中有机酸的含量。
1.3.3 数据处理
采用Excel 2016、Origin 8.5、SPSS 22.0软件对实验数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 麸醋发酵过程中醋醅理化指标的变化
2.1.1 醋醅中水分含量的变化
醋醅中水分含量的高低直接影响着微生物的生长繁殖和代谢活动[19]，其在麸醋发酵过程中的变化见图1。
由图1可知，醋醅中水分含量随发酵的进行呈现出先升后降的趋势，在发酵前3 d，水分含量逐渐升高；在发酵3 d时达到最高，为63.90%；第4～15天，前期下降明显，后期下降缓慢，水分含量均维持在60%以上，总体波动不大。分析原因可能是发酵前期微生物代谢旺盛，产生风味物质、生成水、放热，使麸醋醋醅温度逐渐升高，水分呈增长的趋势；发酵后期，温度的升高使得水分被散发，同时由于麸皮具有较强的吸水能力导致其水分含量下降缓慢。
图1 麸醋发酵过程中醋醅中水分含量的变化
Fig.1 Changes of water contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
不同大、小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 醋醅中总酸含量和pH值的变化
食醋中影响其酸味的主要因素是pH和总酸。总酸是各种酸性物质的总量，其含量是发酵过程中的一个重要理化指标，是检验发酵是否完成的标志[20]。pH所反映的H+浓度决定着食醋酸味的强弱[6]。醋醅中总酸含量和pH值的变化见图2。
图2 麸醋发酵过程中醋醅中总酸含量和pH值的变化
Fig.2 Changes of total acid contents and pH value in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
由图2可知，醋醅在发酵过程中总酸含量一直处于增长的趋势，前期增长迅速，后期较为缓慢。分析原因可能是在发酵前期，醋醅适宜产酸微生物的生长繁殖和代谢活动，生成大量的有机酸，使总酸含量迅速升高；到发酵后期，由于营养物质的消耗和有机酸的积累，使酿造环境处于高酸度、低营养状态，从而导致醋酸菌、乳酸菌等产酸菌代谢缓慢，总酸含量增长缓慢。总酸含量不断增加，pH值逐渐减小，但变化不明显，始终维持在4.0～4.4之间，说明四川麸醋醋醅在发酵过程中形成了一个缓冲体系，pH值始终处于动态平衡。
2.1.3 醋醅中挥发酸和不挥发酸含量的变化
食醋中有机酸包括挥发酸和不挥发酸，其中挥发酸主要是乙酸，不挥发酸主要是乳酸[11]。醋醅中挥发酸和不挥发酸含量的变化见图3。
图3 麸醋发酵过程中醋醅中挥发酸与不挥发酸含量的变化
Fig.3 Changes of non-volatile acid and volatile acid contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
在发酵过程中，挥发酸与不挥发酸含量均呈现逐渐上升的趋势。在发酵0～9 d，不挥发酸的含量高于挥发酸的含量；在发酵9～15 d，挥发酸的含量高于不挥发酸的含量，分析原因可能是由于在发酵前期乳酸菌大量繁殖，代谢产生乳酸等不挥发酸，发酵后期醋酸菌利用前期酵母菌产生的乙醇代谢生成乙酸。不挥发酸含量在发酵前期上升迅速，后期变得缓慢，可能是因为发酵初期未翻醅，醋醅处于厌氧环境，有利于乳酸菌发酵产生乳酸，后期天天翻醅，空气进入使乳酸菌代谢减慢，产物生成降低。挥发酸含量一直呈现明显上升的趋势，是由于醋醅发酵是糖化、酒化、醋化同时进行的，醋酸菌边繁殖边利用酵母产生的乙醇代谢生成乙酸，在营养充足，每天翻醅供氧的条件下，挥发酸含量快速上升。
2.1.4 醋醅中氨基酸态氮含量的变化
氨基酸态氮是食醋重要的组成部分，反映食醋中氨基酸及小肽总体水平，其含量的高低影响着食醋的质量等级和整体风味[21]。醋醅中氨基酸态氮含量的变化见图4。
图4 麸醋发酵过程中醋醅中氨基酸态氮含量的变化
Fig.4 Changes of amino acid nitrogen contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
由图4可知，随着发酵时间的延长氨基酸态氮含量呈现逐渐上升的趋势，且在发酵前期升高的快，后期相对缓慢。氨基酸态氮的来源主要是蛋白质水解生成蛋白胨、肽、氨基酸等。发酵前期快速增加，可能与药曲中酸性蛋白酶水解有关；发酵后期微生物数量减少、蛋白酶活力下降，同时，氨基酸态氮参与麸醋中风味物质的形成，使得氨基酸态氮含量上升缓慢[22]。
2.1.5 醋醅中还原糖含量的变化
还原糖作为一种重要的碳水化合物，在发酵过程主要以葡萄糖和麦芽糖的形式存在，为微生物的代谢活动提供碳源和能源，同时也是形成食醋风味的前提物质[11]。醋醅中还原糖含量的变化见图5。
图5 麸醋发酵过程中醋醅中还原糖含量的变化
Fig.5 Changes of reducing sugar contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
由图5可知，醋醅中还原糖含量在发酵前期不断升高，后期逐渐降低。分析原因可能是发酵初期，微生物的大量繁殖代谢产生淀粉水解酶，原料中的淀粉被分解成葡萄糖、麦芽糖等还原糖，从而使醋醅中还原糖含量上升；发酵后期，微生物代谢活动利用大量的还原糖，使其含量降低，此外，还原糖还参与食醋风味及食醋颜色的形成。
2.1.6 醋醅中淀粉含量的变化
在食醋发酵过程中，淀粉作为其酒化阶段的物质基础，经过液化、糖化作用，转化成糖类等物质，为微生物的生长繁殖、代谢活动提供物质基础和能量来源，使得发酵得以顺利的进行，同时其含量的变化能反映发酵的进度，对食醋酿造生产工艺具有指导作用[23]。醋醅中淀粉含量的变化见图6。
由图6可知，淀粉含量在醋醅发酵过程中呈现持续下降的趋势。分析原因可能是在发酵前期，微生物代谢活动产生各种液化酶、糖化酶等将淀粉迅速降解为还原糖，使其含量下降很快；此后，醋醅发酵以酒化作用为主，淀粉水解酶诱导作用降低、糖化力减弱，导致淀粉含量下降变得缓慢；发酵后期，由于酸的大量积累，使各类酶的活性受到抑制，同时，微生物的生长也受到抑制，淀粉含量变得缓慢。
图6 麸醋发酵过程中醋醅中淀粉含量的变化
Fig.6 Changes of starch contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process
2.2 麸醋发酵过程中醋醅中有机酸分析
2.2.1 有机酸标品的保留时间及标准曲线
通过HPLC对混合有机酸标准溶液进行测定，各有机酸标品的保留时间、回归方程、相关系数及线性范围见表1。
表1 各有机酸的标准曲线
Table 1 Standard curves of each organic acid
由表1可知，9种有机酸的标准曲线的相关系数R2均＞0.99，说明线性关系良好，可用于各有机酸的定量。
2.2.2 麸醋发酵过程中醋醅有机酸组成及含量
采用高效液相色谱法对四川麸醋发酵阶段的醋醅样品中的有机酸组成及含量进行分析，结果见表2。
表2 四川麸醋发酵过程中醋醅有机酸组成及含量分析
Table 2 Analysis of organic acid compositions and contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar
由表2可知，从四川麸醋发酵过程中共检测出8种有机酸，分别为草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。其中丙酮酸含量由发酵初始阶段的0.11 g/100 g干醅上升至发酵结束时的0.38 g/100 g干醅，提高了250%；乙酸含量由1.91 g/100 g干醅上升至5.65 g/100 g干醅，提高了200%；琥珀酸含量从0.21 g/100 g干醅上升至0.44 g/100 g干醅，提高了110%；乳酸含量从2.94 g/100 g干醅上升至4.26 g/100 g干醅，提高了40%；除此之外，其余各种有机酸均随着发酵的进行其含量也有不同程度的增长，但增长较为缓慢。
2.2.3 麸醋发酵过程中醋醅有机酸的变化规律
麸醋发酵过程中含量最高的有机酸为乳酸和乙酸，其总量占有机酸总含量的80%以上，因此对醋醅的总有机酸以及两种主要有机酸（乙酸、乳酸）含量的变化进行分析，结果见图7。
图7 四川麸醋发酵过程中醋醅中总有机酸、乙酸及乳酸含量的变化
Fig.7 Changes of the total organic acids,acetic acid and lactic acid contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar
由图7可知，麸醋发酵过程中，醋醅中有机酸总量呈增长趋势，从发酵初始阶段的（5.76±0.56）g/100 g干醅增长至发酵结束时的（11.55±0.42）g/100 g干醅，增长了100%；乙酸含量在整个发酵过程中逐渐增加，而乳酸含量在发酵前12 d逐渐增加，最高达到（4.16±0.62）g/100 g干醅，这与发酵前12 d乳酸菌的大量增殖有密切的关系；发酵12 d之后乳酸含量开始缓慢下降，这可能是因为某些微生物可以将乳酸转化为其他次级代谢产物所致。
3 结论
四川麸醋发酵过程中醋醅中的水分含量和还原糖含量呈先升后降的趋势，前者在发酵3 d时含量最高，达到63.90%，后者在发酵9 d时含量最高，达到10.13 g/100 g干醅；pH值逐渐降低，但变化缓慢，且始终维持在4.0～4.4之间；淀粉含量不断减少，这与微生物对淀粉的不断降解和生长繁殖代谢对还原糖的利用相关；而总酸含量却一直处于增长趋势，挥发酸、不挥发酸变化趋势与总酸大致相同；氨态酸态氮含量呈逐渐上升的趋势，且在发酵前期升高得快，后期相对缓慢。在麸醋发酵过程中，醋醅中的有机酸总量逐渐升高，从中共检测出8种有机酸，分别为草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。发酵过程中有机酸含量差异较大，但均以乙酸与乳酸的含量最高，是发酵过程中的主体有机酸。
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