高血脂症是指血脂水平过高，主要表现为胆固醇和甘油三酯水平过高。高血脂症常常会并发糖尿病[1]、动脉粥样硬化[2]等疾病，严重危害人体健康。据美国国家卫生统计中心的数据分析，自1999-2012年以来，高胆固醇血症的患病率从1999-2000年的3%增加到2011-2012年的6.3%[3]，同时，高血脂症也越来越趋于年轻化[4]。目前，针对高血脂症的治疗多为化学药物，具有一定的毒副作用[5]，越来越多的人将研究的重点转移到天然活性产物中来[6-7]。大豆蛋白是一种营养价值较高的植物性蛋白质，其必需氨基酸组成符合联合国粮农组织（Food and agriculture organization，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）标准模式，是良好的蛋白质补充剂。大豆蛋白经过物理或化学处理后，得到的大豆多肽不仅具有溶解度高、稳定性好等优良的加工特性[8]，同时还具有多种生理功能活性，包括抗氧化[9-11]、降血压[12-13]、降血脂[14-15]、抗癌[16-17]等，极具研究和开发价值。
目前，国内外对大豆多肽降血脂活性及其作用机制的研究日趋深入，高梦笛[18]利用斑马鱼高血脂模型来研究大豆多肽Lunasin的降血脂活性，推测其机理主要是通过参与胆固醇代谢来调节血脂，进而降低血脂水平。LAMMI C等[14，19]研究发现，从大豆球蛋白中分离出的三个多肽（IAVPGEVA，IAVPTGVA和LPYP）能够通过激活低密度脂蛋白受体-固醇调节元件结合蛋白2（LDLR-SREBP2）途径来抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCoAR）的活性并调节胆固醇代谢，从而增加人肝癌细胞（HepG2）摄取低密度脂蛋白的能力。本研究通过HepG2肝癌细胞构建高胆固醇细胞模型，以大豆蛋白为对照组，分析大豆多肽对HepG2细胞内总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的影响，从而评价大豆多肽的体外降血脂活性。同时，采用凝胶过滤层析法和纳米技术-高效液相色谱-串联质谱（nano-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）技术对大豆多肽的组成和结构进一步分析、鉴定，旨在为降血脂大豆多肽的开发和应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆蛋白（蛋白含量91.90%）：临沂山松生物制品有限公司；大豆多肽（经复合蛋白酶酶解制备而成，蛋白含量为91.25%）：中慈保健品生物有限公司；乙腈（色谱纯）：庞博生物有限公司；橄榄油：益海粮油工业有限公司；胰脂肪酶（酶活力为500 U/mg）、曲拉通X-100（分析纯）、胆固醇（纯度≥99.00%）：美国Sigma公司；最小必需培养基（minimal essential medium，MEM）、总胆固醇试剂盒、甘油三脂试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒：美仑生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
JW-3021离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；HWS-12恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；YX-18HDD高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；HF细胞培养箱：力新仪器（上海）有限公司；RT-6000酶标仪：深圳雷杜生命科学股份有限公司；EASY-nano-LC 1200 Q Exactive plus质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；Acclam PepMap C18分析柱（75 μm×15 cm）：上海希言科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT细胞增殖及毒性实验
利用四甲基偶氮唑蓝（methylthiazalyltetrazolium，MTT）比色法检测不同浓度的大豆蛋白、大豆多肽对HepG2细胞增殖的影响，以此确定最适的样品浓度。取对数期的HepG2细胞（含有1%双抗＋10%胎牛血清的MEM培养基在37 ℃、5%CO2的二氧化碳养箱中培养），加入0.25%的胰酶消化1～2 min，计数，接种于96孔板中，每孔加100 μL，使其细胞数为5 000个/孔，于37 ℃、5%CO2条件下静置培养24 h，每孔更换100 μL新的培养基，添加不同质量浓度（1.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、200.00μg/mL、500.00μg/mL、1000.00μg/mL、5000.00μg/mL）[20]的样品，作用24 h后，弃去上清液，随后添加100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h后，添加一定量的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解液，待底部的结晶紫完全溶解后，将96孔板置于酶标仪上，于波长490 nm处测定其吸光度值，细胞存活率的计算公式如下：
1.3.2 高胆固醇细胞造模实验
待肝癌细胞HepG2铺满细胞瓶底的80%～90%时，用胰酶消化、悬浮、计数，按照终浓度为2×105个/mL接种于96孔板中，在二氧化碳培养箱中静置培养24～48 h，当细胞单层长满孔板底部时，换成无血清培养基，并在培养基中加入不同质量浓度（5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL）的胆固醇溶液，作用24 h后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3遍后，用胰酶消化，完全培养基终止消化。将细胞悬浮液转入离心管中，于1 500 r/min离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，离心，弃上清，用PBS悬浮细胞，细胞破碎仪破碎细胞后，按照试剂盒说明，测定各组细胞内的胆固醇浓度。
1.3.3 大豆多肽对HepG2细胞中TG、TC的影响
待细胞培养瓶中细胞长满瓶底至80%～90%时，用胰酶消化、离心、稀释至一定浓度后，将细胞接种于96孔板中，加入一定浓度的胆固醇于完全培养基中，每孔加样量为2.5mL，作用一段时间后，添加不同质量浓度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的样品，培养24 h，随后吸去上清液，用胰酶消化，离心，PBS清洗3遍，添加250 μL的1%Triton X-100，随后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用TG、TC试剂盒检测其含量。
1.3.4 大豆多肽对HepG2细胞中LDL-C、HDL-C和SOD的影响
待细胞培养瓶中细胞长满瓶底至80%～90%时，用胰酶消化、离心、稀释至一定浓度后，将细胞接种于96孔板中，加入一定浓度的胆固醇于完全培养基中，每孔加样量为2.5mL，作用一段时间后，添加不同质量浓度（10μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的样品，培养24 h，随后吸去上清液，用胰酶消化，离心，PBS清洗三遍，添加250 μL的1%Triton X-100，随后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用LDL-C、HDL-C和SOD试剂盒检测其含量。
1.3.5 体外胰脂肪酶活性的测定
在50 mL的三角瓶中加入4 mL的橄榄油和5 mL pH值为7.5的PBS缓冲液，混匀至乳液状后，置于40 ℃保温5 min，加入1 mL 5 mg/mL的胰脂肪酶，其中空白组加入1 mL的胰脂肪酶，实验组加入1 mL的胰脂肪酶和1 mL的待测样品，混匀后在40 ℃准确反应30 min，以15 mL的体积分数为95%乙醇终止反应后，在溶液中加入2～3滴1%的酚酞指示剂，用0.025 mol/L的NaOH滴定至淡红色出现，并且在30 s内不褪色，记录消耗的NaOH溶液体积，胰脂肪酶活力的计算公式如下[21]：
式中：VA为样品组消耗NaOH滴定液的体积，mL；VB为空白组消耗NaOH滴定液的体积，mL；M为NaOH滴定液的浓度，mol/L；W为胰脂肪酶的取样量，g；T为反应时间，min。
1.3.6 大豆多肽的分子质量分布
采用国标GB/T22492—2008《大豆肽粉》中的检测方法，稍加修改。具体方法如下：采用高效凝胶过滤色谱法进行检测，其中色谱柱为TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）（内径）的凝胶柱，流动相∶乙腈∶水∶三氟乙酸=200∶800∶1（V/V），流速为0.5 mL/min，检测波长为220 nm[22]。
1.3.7 凝胶过滤层析
采用葡聚糖凝胶SephadexG15作为填料，装填至60mm×2.5 mm的玻璃层析柱中，平衡2～3个柱体积后上样，以去离子水为洗脱液，洗脱流速为1 mL/min，检测波长为220 nm，用自动收集器收集各组分，将属于同一峰的组分合并、浓缩并冻干，待后续备用[23]。
1.3.8 Nano-HPLC-MS/MS
将样品复溶于水后经由配备在线纳喷离子源的HPLCMS/MS分析。流动相：0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸-乙腈（B），上样3 μL样品，以线性梯度分离，0～60 min，8%～40%B。柱流量控制在200 nL/min，柱温为40 ℃，电喷雾电压2 kV。
1.3.9 数据分析
串联质谱图经过PEAKSStudioX软件分析。实验数据采用SPSS 23.0进行分析，每组数据均为3次测定的平均值，结果以“平均值±标准差”表示，采用Duncan法进行单因素显著性差异分析，采用t检验进行组间显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 大豆多肽的分子质量分布
通过凝胶过滤色谱法对大豆多肽样品的分子质量分布进行分析，结果见表1。由表1可知，大豆多肽中分子质量在190～451 Da范围内为其主要成分，占68.95%，其次是分子质量在451～1 452 Da范围内的组分，占18.80%，分子质量＞6 500 Da的组分最少，仅占0.94%。其中，分子质量＜1 500 Da的组分占比＞87%，这表明该大豆多肽主要由小分子肽构成。INOUE N等[24]从大豆蛋白酶解液中分离出3个二肽（KA、VK和SY），进一步研究发现，KA、VK和SY均可以显著降低HepG2细胞中甘油三酯的合成量（P＜0.05），其中，SY能够有效抑制载脂蛋白-B的分泌，具有一定的降血脂活性。NAGAOKA S等[25]研究发现，大豆多肽（WAWWMY）的胆酸结合能力与降血脂药物消胆胺相当，能够显著降低大鼠血清、肝脏和肠道的胆固醇含量（P＜0.05）。
表1 大豆多肽的分子质量分布
Table 1 Molecular weight distribution of soybean peptides
2.2 大豆多肽的体外降血脂实验
2.2.1 MTT实验[26]
本实验考察了8个浓度梯度的样品对HepG2肝癌细胞的抑制作用，结果见图1。由图1可知，在1.25～5 000 μg/mL的质量浓度范围内，HepG2细胞的存活率均＞99.00%，这表明在该浓度范围内大豆多肽和大豆蛋白对HepG2细胞不具有细胞毒性作用，且不具有显著性差异（P＞0.05），在此浓度范围内可以进行后续的实验。
图1 大豆蛋白和大豆多肽对HepG2肝癌细胞的存活影响
Fig.1 Effect of soybean protein and soybean peptides on the survival of HepG2 liver cancer cells
不同大写字母与小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）；“*”表示具有显著性差异（P＜0.05），“**”表示具有显著性差异（P＜0.01），下同。
2.2.2 高胆固醇细胞造模实验
图2 不同质量浓度的胆固醇对总胆固醇含量的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of cholesterol on total cholesterol content
以HepG2肝癌细胞来构建高胆固醇细胞模型，其结果见图2。由图2可知，当胆固醇质量浓度＜20 μg/mL时，胆固醇的含量随着胆固醇浓度的增加而增加，胆固醇质量浓度＜20 μg/mL时，胆固醇的含量不再显著增加（P＞0.05），胆固醇质量浓度为20 μg/mL时，对应的胆固醇含量为7.41 mmol/L，高于正常水平时的胆固醇含量，这表明当胆固醇质量浓度为20 μg/mL时，高胆固醇细胞模型构建成功，因此，将此胆固醇质量浓度20 μg/mL作为造模浓度。
2.2.3 大豆多肽对HepG2细胞中TG和TC含量的影响
图3 不同质量浓度的大豆蛋白和大豆多肽对HepG2细胞中TG（a）及TC（b）含量的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on TG (a) and TC (b) contents
以大豆蛋白为对照组，通过添加不同质量浓度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的大豆多肽，研究其对HepG2细胞中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量的影响。细胞中TG含量的变化如图3a所示，在10～100 μg/mL的质量浓度范围内，细胞中TG的含量随着大豆多肽和大豆蛋白浓度的升高而降低，当质量浓度达到100 μg/mL时，大豆蛋白和大豆多肽对应的TG浓度分别为9.8μmol/g和4.6μmol/g，与10μg/mL时对应的TG浓度相比，分别降低了810%和880%。这表明，大豆蛋白和大豆多肽均能够在一定程度上抑制细胞中TG的产生，与大豆蛋白对照组相比，大豆多肽在浓度10μg/mL、100 μg/mL时对TG具有显著性降低作用（P＜0.05）。细胞中TC含量的变化如图3b所示，在10～100 μg/mL的质量浓度范围内，大豆蛋白和大豆多肽对细胞中TC含量的影响与TG基本一致，均与样品浓度呈负相关。100 μg/mL的大豆多肽和大豆蛋白对应的TC浓度分别为2.9μmol/g和2.1 μmol/g，与10 μg/mL的样品浓度对应的TC浓度相比（65.5 μmol/g和78.9 μmol/g），显著降低（P＜0.05）。综合以上分析，大豆多肽能够在一定程度上抑制细胞中TG和TC的产生，且大豆多肽对TG的抑制作用稍强于对照组大豆蛋白。
2.2.4 大豆多肽对HepG2细胞中LDL-C和HDL-C含量的影响[27]
以大豆蛋白为对照组，通过添加不同质量浓度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其对HepG2细胞中LDL-C和HDL-C含量的影响，结果见图4。
图4 不同质量浓度的大豆蛋白和大豆多肽对HepG2细胞中LDL-C（a）及HDL-C（b）含量的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on LDL-C (a) and HDL-C (b)production in HepG2 cells
由图4a可知，细胞中LDL-C的含量与大豆蛋白和大豆多肽的浓度呈负相关。10 μg/mL的大豆蛋白和大豆多肽对应的LDL-C浓度分别为255.3 μmol/g和90.2 μmol/g，而当质量浓度达到500 μg/mL时，对应细胞中LDL-C浓度分别为55.8 μmol/g和2.7 μmol/g，对比降低了460%和3 340%。在相同的样品质量浓度下，大豆多肽对应的细胞中LDL-C浓度要显著低于大豆蛋白。这表明大豆多肽对细胞中LDL-C的抑制作用显著高于大豆蛋白对照组（P＜0.05）。由图4b可知，随着大豆蛋白和大豆多肽浓度的升高，细胞中HDL-C的含量随之升高。当质量浓度为500 μg/mL时，大豆蛋白和大豆多肽对应的细胞中HDL-C浓度分别为54.0 μmol/g和69.2 μmol/g，与10 μg/mL时相比，分别增长了24.4%和37.3%。与对照组大豆蛋白相比，大豆多肽对细胞中HDL-C的产生具有更强的促进作用。综合以上分析，大豆多肽能够抑制细胞中LDL-C的产生并促进HDL-C的产生，且对HDL-C的促进作用显著高于对照组大豆蛋白（P＜0.05）。
2.2.5 大豆多肽对HepG2细胞中SOD活力的影响
以大豆蛋白为对照组，通过添加不同质量浓度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其对HepG2细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响，结果见图5。由图5可知，随着大豆蛋白和大豆多肽质量浓度的增加，细胞中SOD活力随之增加。当样品质量浓度由10 μg/mL增加至500 μg/mL时，大豆多肽的SOD活力由0.634 U/g增加到0.987 U/g，增幅为35.71%。与对照组大豆蛋白相比，在相同质量浓度下，大豆多肽对细胞中SOD活力的促进作用极显著增强（P＜0.01）。综上所述，大豆多肽能够在一定程度上促进细胞中SOD活力，且大豆多肽的促进作用显著高于对照组大豆蛋白（P＜0.05）。
图5 不同浓度的大豆蛋白和大豆多肽对HepG2细胞中SOD活力的影响
Fig.5 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on SOD activity in HepG2 cells
2.3 大豆多肽的分离纯化及鉴定
2.3.1 凝胶过滤层析法
采用Sephadex G-15凝胶柱对大豆多肽进行分离纯化，其结果见图6。
图6 大豆多肽分离纯化凝胶层析图
Fig.6 Gel chromatogram of soybean peptide separation and purification
由图6可知，经过G-15葡聚糖凝胶色谱分离后得到三个主要的多肽峰，分别为E1、E2、E3，根据凝胶层析的原理可知，组分E3为分子量最小的组分，随后将三个组分收集后浓缩、冻干，留待备用。
将上述三个组分用去离子水配制成质量浓度10 mg/mL的溶液，分析各个组分的胰脂肪酶抑制率，结果见图7。由图7可知，纯化后的组分E2、E3与未纯化的大豆多肽相比，其抑制胰脂肪酶抑制率显著性提高（P＜0.05），而与组分E1相比则没有显著性差异，其中组分E3的胰脂肪酶抑制率最高，达22.33%，因此选择纯化后的组分E3用于下一步的纯化和鉴定。
图7 不同组分对应的胰脂肪酶抑制率
Fig.7 Pancreatic lipase inhibition rate of different components
2.3.2 Nano-HPLC-MS/MS
采用Nano-HPLC-MS/MS技术对大豆多肽组分E3进行进一步的分析与鉴定，根据二级质谱中母离子和碎片离子的特性，在数据库中筛选出匹配度最高的多肽序列，该方法为数据库比对法。对于数据库中未匹配到的肽段，可利用碎片离子的质量差，得到对应的氨基酸残基，采用从头测序法进行进一步的分析。通过以上两种方法，可以对大豆多肽进行全面地筛选。
（1）数据库比对结果分析
通过数据库搜库比对匹配后得到的大豆肽段有6744条，最小的大豆多肽为七肽，最大的大豆多肽为四十五肽，分子质量分布在500～5 000 Da，电荷数在1～7之间，大豆多肽最大的峰面积为4.21×109。其中多肽百分含量最高的是九肽，为11.09%，共有748个；其次是十一肽，百分含量为10.97%，共有740个，第三是十二肽；百分含量为9.83%，共有663个；二十肽到四十五肽共有335个，百分含量为4.97%，其中LIDSVLDVVRK百分含量最高，其分子质量为1 255.75 Da，占比为0.31%。
（2）从头测序法结果分析
利用从头测序法鉴定出10 540种多肽，含有2～39个氨基酸，其中十五肽以下的游离肽占比为92.89%，十六肽到三十九肽的数量为749个、十五肽226个、十四肽331，十三肽389个、十二肽460个、十一肽443个、十肽540个、九肽552、八肽690个、七肽973个、六肽1 514个、五肽1 603个、四肽1 439、三肽630个、二肽为1个，含量排在前三位的分别是五肽、六肽和四肽，其中五肽的百分含量最高，占多肽总含量的15.21%。
氨基酸局部置信度（amino acid local confidence，ACL）为从头测序数据结果的置信度，通常认为结果较为可信的，其ACL＞80%，非常可信时ACL＞95%，对此将从头测序结果中ACL＞95%、百分含量最高的4个多肽结果统计在表2中，结果显示，这4个肽中包括1个五肽、2个六肽和1个七肽，对其多肽序列分别为LLDTN、FLEHAF、DFGKFF和LVGLKLY，对应的分子质量分别为574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da。
表2 从头测序法分析的游离肽
Table 2 The free peptides using de novo sequencing methods
3 结论
结果表明，大豆多肽的分子质量＜1 500 Da的组分占比＞87%，主要由小分子肽构成。通过HepG2肝癌细胞构建高胆固醇细胞模型，以大豆蛋白为对照组，分析大豆多肽对细胞内TC、TG、HDL-C、LDL-C和SOD活力的影响。大豆多肽对细胞中TG、TC、LDL-C的产生具有一定的抑制作用，对细胞中HDL-C的产生和SOD活力具有促进作用，且大豆多肽对TG、LDL的抑制作用及对HDL-C和SOD活力的促进作用均强于对照组大豆蛋白，具有良好的体外降血脂活性。通过凝胶过滤层析法和Nano-HPLC-MS/MS技术对大豆多肽进行纯化和鉴定，最终筛选出5个多肽，分别为LLDTN、FLEHAF、DFGKFF、LVGLKLY和LIDSVLDVVRK，对应的分子质量为574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da和1 255.75 Da。本研究表明，大豆多肽具有良好的体外降血脂活性，同时对大豆多肽进行了分离和结构鉴定，这为降血脂大豆多肽的开发和工业化应用提供了新思路和理论基础。
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