无花果（Ficus carica L.）鲜果中含有丰富的维生素、有机酸、矿物质、人体内必需的氨基酸和膳食纤维等[1-2]，是一种药食两用的水果，可以润肠通便，生津止渴，消炎解痛消肿，含糖量高达24%[3]。山楂（Crataegi fructus）又名山里红，含有大量的胡萝卜素和黄酮类化合物等，具有降血脂、降血压、抗心律不齐等作用，同时还具有消食化滞，健胃开脾，活血化痰的功能[4]，但山楂酸度较高，有机酸含量可达4.1%～7.3%[5]。将无花果和山楂混合酿造果酒能更好地协调山楂的酸度高和无花果含糖量高的特点。
目前有分别用山楂、无花果、山楂与谷类酿酒[6-8]的相关报道，但鲜见无花果和山楂复合酒的研究。用无花果酿造的酒中酸度较低，为达到酒品质量标准，需加酸进行成分调整[9]；用山楂酿造的酒中酸含量较高，而进行降酸处理的步骤繁琐、操作困难，且成本增加[10]。将无花果和山楂进行复配，以期弥补酿造果酒中山楂糖度不足、酸过多和无花果酸度不足、糖过多的现象，同时使酿造果酒兼具两种原料共有的特性。
本研究以新鲜山楂和无花果作为原料，采用边浸渍边发酵工艺，研究不同酵母、加糖量、发酵时间和发酵温度对复合果酒发酵工艺的影响，为无花果和山楂的充分利用及丰富果酒种类提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜山楂果（河南豫北红山楂）、无花果（新疆早黄无花果）：市售；葡萄酒酵母CECA、BV818、NSD：安琪酵母有限公司。甲醇标准品（色谱纯）：山东西亚化学工业有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SPX-250B型生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；AL204/01型电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎机：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；pHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；0～50°（20 ℃）酒精计：黄骅渤海比重计厂；Multifuge X1R冷冻离心机：美国Thermo Scientific公司；TU-1810PC紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LC-10AT液相色谱仪：日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 无花果山楂复合果酒的加工工艺流程及操作要点
操作要点：
无花果浆的制备：选取果粒饱满，成熟度高，无腐烂状态的新鲜无花果，用流动的水清洗，沥干水分后去梗，将其切成5 mm厚的薄片。称取50 g无花果薄片，按照料液比1∶9（g∶mL）加水混合，即为无花果浆。
无花果山楂混合果浆的制备：挑选新鲜，颜色鲜红，无虫口腐烂的新鲜山楂果，用流水清洗，沥干水分，用刀去核、去梗、去蒂，然后迅速进行切片，称取切片后的山楂150 g，放入制备好的无花果浆中，将无花果山楂混合液置于80～85 ℃水浴中浸提90 min，待果液冷却后获得无花果山楂混合果汁，制取的混合浆汁液的糖度为24.7 g/L，酸度为6.2 g/L。
调糖：糖度是影响酵母发酵、酒精产生及果酒口感的重要影响因素。添加一定量的蔗糖入无花果山楂混合果浆汁中，糖含量控制在105～185 g/L范围。
添加酵母：将活性干酵母加入28 ℃温水中，水∶酵母=20∶1（g∶mL），然后密封进行活化20 min。活化后的酵母按0.1%接种量加入混合果液中。
发酵：在发酵温度22～38 ℃的条件下发酵2～10 d。
陈酿：取发酵上清液，在4 ℃条件下陈酿28 d，使酒味协调，风味更加突出。
1.3.2 无花果山楂复合果酒发酵工艺优化单因素试验
酵母种类：按照1.3.1方法制备无花果山楂混合浆汁若干份，分别加入4种不同酵母，即CECA、BV818、CECA+NSD（1∶1）和BV818+NSD（1∶1）。在发酵温度30 ℃、发酵时间6 d、加糖量150 g/L、酵母添加量均为0.1%的条件下，分别考察酵母种类对复合果汁发酵的影响。
加糖量：按照1.3.1方法制备无花果山楂混合浆汁若干份，在CECA酵母加入量0.1%，发酵温度30 ℃，发酵时间6 d的条件下，考察蔗糖添加量（105 g/L、125 g/L、145 g/L、165 g/L、185 g/L）对复合果浆汁发酵的影响。
发酵时间：按照1.3.1方法制备无花果山楂混合浆汁若干份，在发酵温度30 ℃，加糖量165 g/L，酵母CECA的添加量0.1%条件下，考察发酵时间（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）对复合果汁发酵的影响。
发酵温度：按照1.3.1方法制备无花果山楂混合浆汁若干份，在发酵时间6 d，加糖量165 g/L，酵母CECA的添加量0.1%条件下，考察发酵温度（22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃）对复合果浆汁发酵的影响。
1.3.3 无花果山楂复合果酒发酵工艺优化响应面试验
响应面分析法用以考察加糖量（A），发酵时间（B），发酵温度（C）对无花果山楂复合果酒发酵的影响。在单因素试验的基础上，无花果山楂复合果酒的发酵条件优化响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 无花果山楂复合果酒发酵条件优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation conditions optimization of fig and hawthorn compound wine
1.3.4 无花果山楂复合果酒的品质分析
（1）感官评定：依据国标GB 15037—2006《葡萄酒》[11]制定出无花果山楂复合酒的感官评分标准。依据20位品酒师的感官品尝，从香气、色泽、味道典型性四个方面对无花果山楂复合果酒进行感官评分，满分100分，评分标准见表2。
表2 无花果山楂复合果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fig and hawthorn compound wine
（2）理化指标：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]测定总糖、总酸、酒精度，杂醇油含量；依据GB 5009.34—2016《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》、GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》、NY/T1600—2008《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定》中方法分别检测二氧化硫、甲醇、单宁的含量[13-15]。
（3）微生物指标：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》中方法测定细菌总数、大肠杆菌数[16]：参照GB 29921—2013《食品中致病菌限量》中方法测定致病菌[17]。
1.3.5 统计分析方法
使用SPSS Statistic 23.0软件进行数据分析；使用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法进行显著性方差分析。
2 结果与分析
2.1 酵母种类的筛选
NSD为产香酵母，发酵能力有限；CECA常用于红色水果；BV818对不良环境抗性较好。不同酵母种类对复合果酒发酵的影响，结果见表3。
表3 酵母种类对无花果山楂复合果酒发酵的影响
Table 3 Effect of yeast species on fig and hawthorn compound wine fermentation
注：字母不同代表差异显著（P＜0.05）。下同。
由表3可知，酵母CECA、BV818、CECA+NSD（1∶1）和BV818+NSD（1∶1）发酵的果酒的酒精度为（6.90±0.40）%vol～（7.30±0.03）%vol，经显著性方差分析，其酒精度无显著性差异（P＞0.05）。其中CECA+NSD（1∶1）发酵果酒感官评分最高，为（88.60±0.12）分，此时酒液果香浓郁，口感均衡。一般情况下，CECA更适合干红葡萄酒和红色水果，BV818虽然对不良环境抗性较好，但其口感较差。因此，确定无花果山楂复合果酒酿造的最佳酵母组合为CECA+NSD（1∶1）。
2.2 加糖量对复合果酒发酵的影响
考察加糖量对复合果酒发酵酒精度和感官评分的影响，结果见图1。
由图1可知，随着加糖量在105～185 g/L范围内的增加，果酒的酒精度逐渐增加，加糖量在165 g/L时达到（7.90±0.40）%vol，随着糖量的继续增加，酒精度升高不显著（P＞0.05）。加糖量在105～165 g/L时，复合果酒感官评分逐渐升高，当加糖量达到165 g/L时，复合果酒感官评分最高，为（90.60±0.60）分，随着糖量增加至185 g/L时，复合果酒感官评分显著下降至（86.70±1.70）分（P＜0.05）。这可能是因为当加糖量达到165 g/L时，酒液中残糖、酸性物质和单宁等含量适中，所以口感较佳，再继续增加糖的量，酒的甜度太高，破坏了酒香味，感官评分降低。因此，复合果酒发酵最佳加糖量为165 g/L。
图1 加糖量对无花果山楂复合果酒发酵的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on fig and hawthorn compound wine fermentation
2.3 发酵时间对复合果酒发酵的影响
发酵时间过短，果酒会发酵不完全，从而达不到酒精度的要求；发酵时间过长则会导致酒的口感变差，甚至会有腐败变坏的后果[18]。考察时间对复合果酒发酵酒精度和感官评分的影响，结果见图2。
图2 发酵时间对无花果山楂复合果酒发酵的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on fig and hawthorn compound wine fermentation
由图2可知，随着发酵时间在2～10 d范围内的增加，复合果酒酒精度在第6天之前大幅度增加，第6天达到（7.80±0.20）%vol，随后酒精度变化不明显，保持在（7.90±0.00）%vol不变。感官评分在发酵时间为2～6 d范围内逐渐增加，第6天达到最高，为（90.10±0.64）分，第6天之后感官评分值逐渐降低。因此，复合果酒最佳发酵时间是6 d。
2.4 发酵温度对复合果酒发酵的影响
发酵温度对果酒发酵有很大影响。KILLIAN E等[19]认为，发酵温度低可以改善产品质量，但进一步降温就会破坏这种平衡。考察温度对复合果酒发酵酒精度和感官评分的影响，结果见图3。
图3 发酵温度对无花果山楂复合果酒发酵的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on fig and hawthorn compound wine fermentation
由图3可知，随着发酵温度在22～30 ℃范围内的增加，果酒的酒精度随之增加，并在发酵温度30 ℃时达到最大值，为（7.80±0.15）%vol，当发酵温度高于30 ℃之后，其酒精度在逐渐减少，原因可能是酵母对高温没有耐受性，温度过高会使酵母失活；感官评分值在26 ℃时达到最高，为（91.20±0.35）分，之后随着发酵温度的升高，其感官评分值逐渐降低。因此，复合果酒发酵的最佳温度是26 ℃。
2.5 发酵工艺优化响应面试验结果
在单因素试验结果基础上，以加糖量（A），发酵时间（B），发酵温度（C）为考察因素，感官评分（Y）为响应值，采用Box-Benhnken 设计方案进一步优化发酵工艺，响应面试验设计结果见表4，方差分析见表5。
表4 无花果山楂果酒发酵条件优化响应面试验设计结果
Table 4 Design and results of response surface experiments design for fermentation conditions optimization of fig and hawthorn compound wine
表5 回归模型方差分析及显著性检验
Table 5 Variance analysis and significance test of regression model
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
采用Design-Expert 8.0.5 软件对表4数据进行多元回归拟合，得到感官评分（Y）对加糖量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）的二次多项回归方程为：Y=93.78+2.34A+4.16B+3.68C+5.10AB-2.38AC+1.92BC-9.02A2-7.46B2-6.99C2。
由表5可知：该回归方程模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P值=0.083 3＞0.05，失拟性检验结果不显著。决定系数R2=0.979 4，调整决定系数R2Adj=0.952 8，说明模型可解释97.94%的可变性，回归模型有高度相关性，可以应用于无花果山楂复合果酒酿造工艺研究的理论预测。对模型回归方程系数显著性试验说明，一次项A，交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），一次项B、C、交互项AB、二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项BC对结果影响不显著（P＞0.05）。各因子对感官评分的影响依次是B（发酵时间）＞C（发酵温度）＞A（加糖量）。
2.6 响应面结果分析
响应值和各试验因子构成间的立体曲面和等高线见图4。由图4a可知，当发酵时间一定时，感官评分随加糖量增加，呈先增大后减少的趋势。当加糖量一定时，感官评分随着发酵时间增加，呈先增大后减小的趋势。等高线紧密，说明感官评分在试验变化范围内存有极高值，交互影响作用显著，和方差分析结果相同。
由图4b可知，当发酵时间一定时，感官评分随发酵温度上升而呈先增大后减少的趋势。当发酵温度一定时，感官评分随发酵时间增长而呈先增大后减小的趋势。图中等高线紧密，说明感官评分在试验变化范围内有极高值，交互影响作用显著，和方差分析的结果相同。
图4 加糖量、发酵时间及发酵温度交互作用对无花果山楂复合果酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sugar addition,fermentation temperature and time on sensory score of fig and hawthorn compound wine
由图4c可知，当发酵温度一定时，随着加糖量增加感官评分呈先增大后减少的趋势。当加糖量一定时，感官评分在发酵温度增加时，呈现出先增大后减小的趋势。图中等高线紧密，说明感官评分在试验变化范围内存有极高值，与方差分析结果相同。
2.7 响应面验证试验
通过回归模型的预测得到无花果山楂复合果酒的最佳发酵工艺为加糖量为169.03 g/L，发酵时间为6.77 d，发酵温度为27.13 ℃。此时感官评分的理论值为95.33分。为了便于实际操作，将发酵工艺参数修正为加糖量169 g/L，发酵时间7 d，发酵温度27 ℃。在此优化条件下，感官评分实际值为95.30分，与理论预测值误差较小，证明该模型可有效预测无花果山楂复合果酒工艺研究。
2.8 无花果山楂复合果酒的质量分析
无花果山楂复合果酒酒香纯正，清澈透亮，呈浅红色。酒精度为7.8%vol，总糖为1.15 g/L，总酸为6.85 g/L，单宁含量为39.05 mg/L，甲醇含量为0.002 g/100 mL，杂醇油含量为0.001 g/100 mL；细菌总数为15 CFU/mL，大肠杆菌数为1 MPN/100 mL，未检测出致病菌。其品质指标均符合相关国家标准[20]。
3 结论
在单因素试验的基础上，应用响应面工艺优化，预测得到无花果山楂复合果酒工艺最佳工艺参数为：选用酵母为CECA+NSD（1∶1），加糖量169 g/L，发酵时间7 d，发酵温度27 ℃。此优化条件下得到复合果酒酒精度为7.8%vol，感官评分为95.30分，酿造的复合果酒口感酸甜协调，果香浓郁。各项理化指标及微生物指标均符合相关国家标准。
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