啤酒是人们日常生活中的重要饮品，是以啤酒花和麦芽为原料，经糊化、糖化、液态发酵后酿制而成的酒精饮料[1-4]。啤酒酿制过程中会产生多种糖类、糖醇、醇类，它们是啤酒中重要的营养物质和风味物质，直接影响啤酒的口感、风味和品质。糖类化合物是一类多羟基醛或酮，是人体生命活动的能源物质，是许多食品和饮料的重要成分[5-7]。糖醇是糖类的醛基或者酮基被还原后的物质，通常是由对应的糖经过催化氢化而生成的甜味剂，具有预防糖尿病、热量低、口感好等优点[8-10]。醇类是某些发酵食品中的重要组分，某些醇类有益于人体健康，但是某些醇类如丁二醇，具有一定的毒性[11-12]。因此，啤酒中糖类、糖醇和醇类组分含量的测定具有重要的现实意义。
目前，糖类、糖醇、醇类的检测方法主要有液相色谱法[13]、液相色谱质谱联用法[14]、气相色谱法[15-16]、酶电极法[17]、离子迁移谱法[18]、离子色谱法[19]。液相色谱法通用方便，但灵敏度低，对复杂基质的样品测定困难；气相色谱法灵敏度高，但是需要衍生，定量重复性差，不适宜做准确定量分析；酶电极法一般仅对一种糖类进行测定，具有较好的特异性，但是不能进行多组分同时测定；液相色谱质谱联用法和离子迁移谱法成本较高，广泛普及应用的难度较大。离子色谱法，是一种简便、灵敏、准确、可同时分析多类别多组分的技术方法，在食品检测领域应用广泛。OWEN B等[20]采用脉冲安培检测-离子色谱法测定了甘露醇、山梨醇、葡萄糖三种物质；张水锋等[21]采用脉冲安培-离子色谱方法分析了婴幼儿乳粉中麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖6种组分，但是研究组分数量较少。
本研究采用积分脉冲安培检测（integrated pulse amperometric detection，IPAD）-离子色谱（ion chromatography，IC）法，通过深入研究色谱分离的影响因素，优化色谱分析条件，建立了啤酒中23种糖类、糖醇、醇类同时测定的方法，该方法快速、灵敏、准确、选择性好，解决了当前啤酒中多类别多组分测定时人力物力成本高、检测效率低的技术难题，且无有毒有害试剂使用，具有良好的经济价值和环保效益。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2,3-丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、岩藻糖、麦芽糖醇（纯度均＞98%）：上海安谱实验科技股份有限公司；木糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖（纯度均＞98%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2-脱氧-D-葡萄糖（纯度＞98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；氢氧化钠（色谱纯）Fisher Chemical公司；盐酸（色谱纯）：美国Merck公司；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）、IC-RP10柱（1 cc）和IC-H10柱（1 cc）：美国Agela Technologies公司；所测样品为随机抽取的市售啤酒。
1.2 仪器与设备
ICS5000离子色谱仪（配备电化学检测器和自动进样器）：美国Thermo Scientific公司；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore公司；DL-360E智能超声波清洗器：上海之信仪器有限公司；ML802/02电子天平：瑞士梅特勒公司。
1.3 方法
1.3.1 离子色谱条件
Dionex CarboPacTM MA1色谱分离柱（4 mm×250 mm），Dionex CarboPacTM MA1保护柱（4 mm×50 mm）；积分脉冲安培检测模式；工作电极：Gold（Au）；参比电极：AgCl电极；电位波形：Gold，Carbo，Quad；流动相：NaOH淋洗液；流速：0.45 mL/min；柱温：29 ℃；进样量：10 μL。NaOH溶液淋洗液条件，0～75 min：480 mmol/L；75～80 min：480 mmol/L增至600 mmol/L；80～105min：600 mmol/L；105～110 min：600 mmol/L降至480 mmol/L；110～120 min：480 mmol/L。
1.3.2 前处理方法
移取啤酒样品约10 g，超声30 min（去除二氧化碳）。准确取超声后待检样品0.100 g，加入去离子水约150 mL，摇匀静置15 min，全部转移至200 mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过已预活化的IC-H10柱（去除重金属离子），再过0.22 μm水相滤膜，最后过已预活化的IC-RP柱（去除有机物和其他杂质离子），弃去前3 mL，收集清液，待上机测定。
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化
2.1.1 梯度淋洗液的选择
先后采用了NaOH溶液、NaAc溶液、NaOH溶液和NaAc溶液的梯度淋洗溶液这三种淋洗液，进行分析测定对比，发现采用单纯的NaOH溶液淋洗液测定23种糖类、糖醇、醇类的分离效果最好。而后进行了NaOH溶液的等度和梯度淋洗液浓度条件下分离实验，发现在梯度淋洗条件下，组分分离并不理想，随着淋洗溶液中氢氧化钠浓度的变化，基线出现不同程度的漂移，直接影响了定性定量分析；等度淋洗条件下，基线平衡较好，组分分离良好。因此，选取等度NaOH淋洗液进行组分分离实验（80 min后采用高浓度NaOH淋洗液冲洗色谱柱），23种组分混合标准溶液的离子色谱图见图1。由图1可知，23种组分检出的主要顺序依次是醇类、糖醇类、糖类，各组分分离良好。
图1 23种组分混合标准溶液的离子色谱图
Fig.1 Ion chromatogram of mixed standards solution of 23 kinds of components
1.2,3-丁二醇；2.乙醇；3.甲醇；4.丙三醇；5.赤藓糖醇；6.木糖醇；7.岩藻糖；8.阿拉伯糖醇；9.山梨醇；10.海藻糖；11.核糖醇；12.甘露醇；13.2-脱氧-D-葡萄糖；14.甘露糖；15.蜜二糖；16.葡萄糖；17.麦芽糖醇；18.果糖；19.乳糖；20.核糖；21.蔗糖；22.棉子糖；23.麦芽糖。
2.1.2 流速的选择
考察了0.40 mL/min、0.45 mL/min、0.50 mL/min流速条件下组分分离状况，结果表明，流速越大，压力越大，组分保留时间缩短，流速从0.40 mL/min增至0.50 mL/min，23种组分总保留时间由80 min降至62 min，而系统初始压力由8.1MPa增至10.0MPa。在0.40mL/min流速时，因为流速较低，压力较小，导致组分峰宽较大，总保留时间较长。0.50 mL/min流速时，系统压力较大，组分总保留时间缩短，但在75 min后使用600 mmol/L NaOH淋洗液冲洗色谱柱，系统压力由10.0 MPa升至12.7 MPa，接近色谱柱最高操作压力13.8 MPa，对色谱柱的使用寿命和系统的整体稳定性不利。0.45mL/min流速时，初始压力为9.0 MPa，最高压力为11.5 MPa，压力适中，而且分离度比较理想，23种组分在70 min内全部出峰。由此可见，增大流速可以提高色谱柱的压力和理论塔板数，从而缩短保留时间，但是不能改变分离度和组分的洗脱顺序，从减少分析时间、提高色谱柱寿命、维持系统稳定角度考虑，选择在0.45 mL/min流速条件下进行实验。
2.1.3 NaOH淋洗液浓度的选择
为了提高23种组分的分离度和灵敏度，进行了初始NaOH淋洗液浓度分别为450 mmol/L、470 mmol/L、480 mmol/L、490 mmol/L、500 mmol/L条件下的对比实验，结果见图2。由图2可知，随着淋洗浓度逐步增大，多数组分保留时间逐步减小，但是醇类和糖醇组分受淋洗液浓度的影响较小，如组分1～6、8、11和12。这是因为醇类和糖醇含有羟基，在水溶液中几乎呈中性，而糖类是多羟基（2个或以上）的醛类或酮类化合物，易发生水解，糖类的分子结构和物化特性决定了其在MA1离子色谱柱上的保留较糖醇和醇类更强，受氢氧化钠淋洗液浓度的变化影响更大。恰好能利用23种糖类、糖醇、醇类组分在不同浓度的氢氧化钠溶液淋洗条件下，在色谱柱上保留特性的差异，来优化改进组分间的整体分离度。
图2 不同NaOH淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.2 Ion chromatogram of mixed standard solution at various NaOH eluate concentrations
淋洗浓度为450 mmol/L时，组分7和8、组分19和20的分离度不高，组分10和11几乎重叠；淋洗浓度为470 mmol/L时，组分10和11分离度不高；淋洗浓度分别为490 mmol/L、500 mmol/L时，组分14和15分离度明显下降，而组分18和19未完全实现分离；而淋洗浓度为480 mmol/L时，这23种组分的整体分离度和灵敏度最为理想。因此，从整体分离效果来看，选择淋洗浓度480 mmol/L进行实验测定。
2.1.4 柱温的选择
考察了26 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、32 ℃色谱柱温度条件下组分分离情况，结果见图3。
图3 不同柱温下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.3 Ion chromatogram of mixed standard solution at different column temperature
由图3可知，随着柱温的升高，组分总保留时间缩短，其中组分7和8、组分9和10的之间分离度越来越小，而组分17和18分离度越来越大。从分析温度点看，26 ℃时，组分10和11、组分17和18这两对组分几乎重叠；28 ℃时，组分10和组分11之间的分离度不高；30 ℃时，组分18和19之间的分离度较小，不能满足定量分析的要求；32 ℃时，组分18和19完全重叠，组分7和8、组分9和10、组分14和15这三对组分分离度较小；29 ℃时，23种组分的分离度和灵敏度均比较理想。由此可见，温度对23种组分同时测定具有显著的影响，每一摄氏度的变化就会导致两种或几种组分不能有效分离。从提高方法的分离度、灵敏度、选择性角度考虑，选取在29 ℃柱温条件下进行实验分析。
2.2 线性范围与检出限
配制7个不同浓度水平的混合标准工作液，其中甲醇质量浓度范围在10.0～1 000 mg/L、乙醇质量浓度范围在2.0～200 mg/L，其他组分浓度范围在0.025～10.0 mg/L之间，以各待测物质质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行检测和校准曲线拟合，并计算待测组分的检出限（S/N=3），结果见表1。由表1可知，23种组分线性相关系数R2均＞0.999，其中有18种组分相关系数R2＞0.999 5，同时23种组分线性方程截距的绝对值均＜0.008，这充分说明在此实验条件下，23种组分同时测定的方法稳定、线性良好。除了甲醇和乙醇外，其他21种组分检出限在0.011～0.197 mg/L之间。
表1 测定组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限
Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and limits of detection of determination components
2.3 回收率与精密度试验
抽取1种啤酒样品，依次向样品中添加质量浓度水平分别为0.20 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L的混合标准溶液，每个浓度水平进行6次平行实验，来验证方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后测定浓度来计算回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。由表2可知，23种糖类、糖醇、醇类组分在三个添加浓度水平下的回收率在81.27%～106.12%之间，精密度试验结果RSD在1.53%～10.52%范围内。回收率、精密度试验结果均符合食品理化检测要求[22]，表明该检测方法精密度和准确性良好。
表2 回收率及精密度试验结果
Table 2 Results of recovery rates and precisions tests
2.4 实际样品的检测
依次抽取5种代表性啤酒（1-黄啤酒、2-黄啤酒、3-黄啤酒、4-黑啤酒、5-黑啤酒），按照离子色谱条件和前处理步骤，进行了实际样品中23种糖类、糖醇、醇类组分含量的检测分析，各样品离子色谱图见图4，检测结果见表3。
图4 5种啤酒样品中23种糖、糖醇及醇测定的离子色谱图
Fig.4 Ion chromatogram of 23 carbohydrates,sugar alcohols and alcohols in beer samples
表3 啤酒样品的23种糖、糖醇及醇测定结果
Table 3 Determination results of 23 carbohydrates,sugar alcohols and alcohols in beer samples
注：“ND”表示未检出。
由图4可知，测定基线稳定，组分分离效果好，受其他干扰较小，这说明此方法稳定性好、适用性强。由表3可知，五种啤酒中检出的糖类、糖醇、醇类组分总数量依次是13、16、14、17、15种，啤酒中检出有益组分的种类越多、含量越大，该啤酒的品质就越好，实验测定结果与样品实际品质状况完全相符。从检出组分来看，检出含量较大的组分依次是丙三醇、乙醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。从啤酒种类来看，黑啤酒中糖类、糖醇比黄啤酒中的种类和含量更加丰富。
3 结论
本研究通过对流速、淋洗液浓度、色谱柱温度等实验影响因素的分析讨论，探索出了适于23种糖、糖醇及醇类同时检测的色谱分析条件，建立了积分脉冲安培-离子色谱法同时测定啤酒中23种糖、糖醇及醇类的分析方法。当流速为0.45 mL/min，淋洗浓度为480 mmol/L，柱温为29 ℃时，23种组分在各自的质量浓度范围内具有良好的线性关系（R2＞0.999）。除了甲醇和乙醇外，其他21种组分检出限（LOD）在0.011～0.197 mg/L；在0.20 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L三个添加浓度水平下，23种组分的回收率为81.27%～106.12%，精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为1.53%～10.52%。该方法简便、快速、灵敏、准确，完全适于啤酒酿制加工、质量控制和安全监管等过程中多种糖、糖醇及醇类的快速筛查分析。
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