辣椒由于其鲜艳的颜色、复杂的辛辣味和香气以及抗氧化、镇痛等功效，在全世界都被广泛食用。不同品种的辣椒物理性质、风味特点、抗氧化能力等都存在一定差异[1]。小米椒是辣椒的一种，个体较小，红带橙色。小米椒发酵制品是我国传统的发酵调味品之一，其风味独特，酸辣可口，能促进食欲，同时还有防腐抗氧化等功能[2-4]。
辛辣味是辣椒制品最主要的属性之一，但是挥发性化合物与辣椒风味息息相关，风味是辣椒及其制品品质的重要内容，且消费者接受食物的主要选择标准之一就是风味，因此对辣椒及其制品的挥发性化合物的研究至关重要，探索辣椒发酵过程中主要香气贡献物的形成与变化可为生产工艺的调控提供有价值的信息[5]。成熟的小米椒主要挥发性化合物是酯类和萜烯类化合物，主要包括4-methylpentyl 5-methylpentanoate、4-甲基戊基2-甲基丁酸酯、3-甲基丁酸甲酯、（R）-柠檬烯、萜品烯等，赋予小米椒柑橘香、甜香和果香[6]。巴西辣椒也是以果香为主，但不同品种的巴西辣椒主要挥发性化合物存在差异，Malagueta辣椒以酯类为主，Murupi辣椒倍半萜类物质为主，Dedo-de-moça辣椒则以醛类和甲氧基吡嗪类为主[7]。辣椒经过不同的处理风味也会存在差异，烟熏的辣椒具有较为强烈的烟熏香气味，品质较高，与之相关的物质主要是酯类和醇类，烘干的辣椒保留水果香，以醛类为主，晒干的辣椒有稻草香，品质较低[8]。除辣椒干制外，辣椒发酵也是常见的辣椒加工方式，其能保持鲜椒口感，又耐贮藏。不同品种辣椒发酵后风味物质差异较大，黄平线椒以酯类物质；施秉线椒和大方皱椒以醇类物质相对含量最高；百宜平面椒和花溪党武辣椒以烃类为主[9]。在发酵过程中辣椒的风味也会发生变化，朝天椒剁辣椒在自然发酵前后最主要的风味成分都是烯烃类化合物，但是发酵过程中酯类和酸类物质相对含量都显著增加[10-11]。
目前辣椒的发酵多采用自然发酵，风味受影响因素较多，难以推测其变化机理。因此本课题将小米椒进行恒温发酵，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）对小米椒发酵过程中不同时期香气物质组成进行分析，研究发酵小米椒在制作过程中香气物质组成的变化，以及香气成分的动态变化规律，以期为小米椒的发酵工艺优化、品质保证以及发酵过程中风味调控提供理论科学依据，同时，该研究对在工业生产中恒温条件下控制发酵时间获得发酵小米椒的最佳风味具有参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米椒、大蒜、蔗糖、食用盐、纯净水、白醋、味精：市售。
实验所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BT423S型电子天平：德国赛多利斯公司；SQ8/Clarus 680气相色谱质谱联用仪：美国Per-kinElmer公司；57318 CAR/PDMS（75 μm）萃取头、Supelco手动固相微萃取装置：美国Supelco公司；15 mL顶空瓶：北京谱朋科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
参照易宇文等[3]的发酵方法，选取清洗干净无破损的小米椒置于发酵坛中，加入2%蔗糖、10%食盐、6%醋、0.2%味精、0.5%大蒜以及纯净水，搅拌均匀，密封，置于28 ℃恒温培养箱中发酵16 d，每隔2 d取样。所取样品装于取样袋中，置于4 ℃冰箱中，备用。
1.3.2 感官评价
挑选有品评经验的14名食品专业学生（7男7女）组成品评小组，参照参考文献[2]的方法，从色泽、体态、香味、质感和滋味五个方面进行感官评分。品评员评分时，在口中充分咀嚼后咽入，每个样品重复评价3次，每次品尝前后用温水漱口。
1.3.3 气相色谱质谱分析
参照KANG K M等[12]的方法，并略作改动。顶空条件：称取4 g捣碎的小米椒于15 mL顶空瓶中，平衡温度70 ℃，时间30 min，然后将老化（250 ℃，10 min）的萃取头（75 μm CAR/PDMS）插入顶空瓶中吸附30 min，再将萃取针头插入气相色谱仪进样口，250 ℃条件下解吸4 min。
气相条件：进样口温度250 ℃；色谱柱Elite-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持3min。载气：氦气（He）（纯度99.999 9%），流速1 mL/min，分流比10∶1。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子轰击能量为70 eV，离子源温度230 ℃，溶剂延迟1 min；全扫描；质量扫描范围：33～500 m/z；标准调谐文件。
定性与定量分析：将质谱图与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）2011版标准质谱库对照，正反匹配度均＞700，并比对相关文献进行确定，定量分析采用峰面积归一化法。
1.3.4 数据处理
用软件Excel、SPSS 20.0、Origin 8.5和HemI进行数据处理及分析。
2 结果与分析
2.1 感官评价分析
小米椒发酵过程中感官变化见图1。
图1 小米椒发酵过程中感官评分雷达图
Fig.1 Radar plot of sensory score of shimatogarashi during the fermentation
由图1可知，在发酵过程中，小米椒的色泽评分先降后增，新鲜小米椒颜色鲜艳，发酵中色素可能分解，而在微生物的作用下又会产生新的变化；而随着发酵时间的延长，小米椒的体态和质感变化不显著，在发酵起始，小米椒的形态最完整，脆度最好；小米椒香味和滋味都在14 d达到最高，发酵香气浓郁，酸辣味纯正柔和，口感协调，在16 d有所下降，因此设置发酵时间为16 d，来研究此段发酵时间里小米椒的风味物质的变化。
2.2 小米椒发酵过程中挥发性成分种类的变化
9个不同发酵时间的小米椒经GC-MS检测共鉴定出144种挥发性成分，包括29种酯、48种烃、25种醇、8种酮、17种醛、4种酚、3种呋喃、4种含氮类、9种含硫类和1种酸，每类物质的相对含量和数量见表1。发酵辣椒的挥发性风味物质的数量主要取决于辣椒品种以及发酵工艺。欧阳晶等[11]以坛坛香4号红线椒为原料进行高盐发酵，在高盐发酵辣椒中共检测到66种化合物，其中酯类最多，有18种；路宽等[9]的研究表明，不同品种辣椒发酵后挥发性成分差异较大。小米椒在发酵过程中挥发性成分种类和数量都在发生变化。在发酵初期，小米椒含有66种物质，相对总含量78.23%，其中最主要的是烃类化合物，成熟的小米椒中萜烯类化合物占主要部分[6]；其次是酯类物质和醇类物质；发酵初期没有呋喃类和含氮类物质，但含硫类化合物种类较多。随着发酵的进行，总的挥发性成分种类整体上先增加后减少，在14 d时种类最多为71种，且相对含量最高为97.12%。酯类和烃类在发酵中也是先增后减的趋势，酯类主要是微生物代谢产生的酶催化生成，在发酵6～12 d相对含量较高。烃类化合物在发酵第14天相对含量最高，达到60.95%。醇类在发酵过程中逐渐减少，而醛类与之相反，逐渐增加，酮类和酚类没有明显变化。酸类仅在发酵14 d的样品中检测到，有且仅有一种酸。含氮类化合物种类较少，且在一些样品中未检测到，在第14天的样品中相对含量相对较高，为2.49%。含硫类化合物相对含量较高，在发酵第2天和第4天相对含量较低，分别为6.87%、5.62%，最高达到19.82%。
表1 不同发酵时间的小米椒挥发性成分种类及相对含量
Table 1 Types and relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time
注：“-”未检出，下同。
2.3 小米椒发酵过程中挥发性香味物质的变化
小米椒中各挥发性成分的相对含量见表2，对小米椒中相对含量大于1%的组分进行热图分析，结果见图2。
从表2和图2可以看出，在小米椒发酵的16 d内，最主要的挥发性成分都是烃类物质，相对含量最高的是香树烯，分别是7.18%、13.63%、15.17%、14.82%、12.28%、11.82%、8.50%、11.98%、17.56%，其次是二甲基十三烷、2-甲基-1-十四（碳）烯、2-甲基四癸烷。烷烃类物质香气较弱，一般不作为发酵辣椒的呈香物质[9]，而烯烃类物质一般阈值较低，且相对含量较高、种类丰富，是发酵辣椒中的主要呈香物质，呈现丰富的木材、水果和香料的复合香[7]。在辣椒粉中，烯烃类物质对其风味也有较大贡献。
酯类物质是发酵小米椒中的第二大挥发性成分，其中2-甲基丁酸己酯相对含量较高，从发酵起始到终止其相对含量分别是4.82%、2.26%、1.11%、3.24%、3.52%、2.72%、6.26%、2.34%、2.81%。另外，相对含量＞1%的酯类还有柳酸甲酯、己酸己酯、反式-4-癸烯酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸芳樟酯。辣椒在成熟过程中，酯类物质含量逐渐下降，在发酵过程中，酯类物质主要是由有机酸和醇类物质在酶的作用下酯化形成，提供强烈的果香，且阈值较低[13]，是辣椒制品的重要呈香物质。
除烃类和酯类外，醇类是发酵小米椒的第三大类物质，最主要的是乙醇和芳樟醇。乙醇在发酵过程中由于酵母菌的酒精发酵作用，相对含量逐渐增加，分别是0.24%、1.08%、1.64%、2.35%、2.13%、3.02%、3.96%、5.21%、5.34%，在发酵12 d到14 d，乙醇含量增幅显著（P＜0.05），使小米椒具有特殊的酒香气。与乙醇变化趋势相反的有正己醇、正庚醇、蘑菇醇、反式-橙花叔醇、α-松油醇以及芳樟醇，其中以芳樟醇相对含量较高，在发酵过程中分别是4.40%、3.98%、2.19%、1.29%、2.26%、1.88%、2.17%、1.68%、0.21%，在辣椒汁的发酵过程中，芳樟醇的含量也是逐渐降低，赋予小米椒青香[14]。另外，正己醇具有果香和甜椒香，庚醇具有蘑菇香和脂肪香，苯甲醇具有花香和果香[15]，整体丰富了发酵小米椒的香气。
表2 不同发酵时间的小米椒挥发性成分相对含量
Table 2 Relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time
续表
续表
图2 小米椒挥发性成分聚类热图
Fig.2 Cluster heatmap of volatile components of shimatogarashi
醛类和酮类物质虽然在小米椒中相对含量较低，但两种物质阈值也较低[16]，对小米椒发酵后的整体风味具有重要作用。醛类物质在发酵过程中种类和相对含量都在逐渐增加，在发酵初期，只有（E）-2-庚烯醛和巴豆醛，两者相对含量分别是0.79%和0.12%；在发酵14 d时，醛类物质种类最多且总的相对含量最高，分别有2-己烯醛（0.15%）、（E）-2-庚烯醛（1.38%）、巴豆醛（0.35%）、反式-2-壬烯醛（0.33%）、反，反-2,4-庚二烯醛（0.28%）、正己醛（0.26%）、苯甲醛（0.26%）、反式-2-戊烯醛（0.26%）、十五醛（0.22%）、苯乙醛（0.12%）。醛类一般呈现青草香和脂肪香，气味较好，但过量的醛会引起食品的酸败和苦涩味[17]。在本研究中，发酵16 d时，醛类物质有下降趋势。酮类物质相对含量在发酵过程中变化较小，但种类变化较大，仅有BETA-二氢紫罗兰酮在发酵各个阶段均存在。酸类物质仅有乙酸在发酵14 d的样品中检测到，可能是因为在这个发酵体系中植物乳杆菌和酵母菌的产酸能力较弱。有研究表明，在发酵的辣椒汁中检测到13种酸类，包括乙酸、辛酸、壬酸等；在发酵鲊辣椒中检测到5种酸，但其中不含乙酸，说明不同品种辣椒发酵产酸情况不一样[14，18]。
呋喃类物质在小米椒发酵前期未能检测到，在发酵第14天检测到2-正戊基呋（0.79%）和2,3-二氢苯并呋喃（0.12%），阈值较低，具有黄油和八角的味道。含氮类物质在也是在发酵14 d时含量相对含量最高，含有氨基甲酸铵（2.21%）和N-甲基吡咯（0.28%）两种。除上述物质之外，还有特殊香味的含硫类化合物，在大蒜和洋葱中含硫类物质含量较高[9]。在发酵过程中含硫类物质最高相对含量达到19.82%，形成了发酵小米椒独特的风味，在发酵10 d后相对含量逐渐下降，其中以二烯丙基二硫为主，其相对含量分别是12.64%、5.23%、4.99%、12.87%、7.72%、16.76%、13.92%、10.67%、6.53%。二烯丙基二硫具有生物活性作用，能够诱导人胃癌细胞分化、抑制其侵袭[19]。在发酵后期，小米椒中还含有烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚等。
2.4 小米椒发酵过程中的风味差异分析
在图2中，热图横轴是通过聚类分析得到的发酵过程中小米椒样品的聚类情况[20]，可以看出刚开始发酵的小米椒的风味与后面发酵过的差异较大，发酵2 d和4 d的较为相似，10 d和12 d的较为相似，较为奇怪的是发酵8 d与14 d以及16 d的风味差异不大。
为了验证热图聚类结果，根据小米椒发酵过程中的挥发性化合物，对小米椒进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图3。PCA通过降维分析能够考察多个变量间的相关性以及差异性，分析结果中第1主成分（PC1）的方差贡献率为54.690%，第2主成分（PC2）的方差贡献率为40.888%，总和＞95%，能够很好地反映各样品信息并体现出样品之间的差异。从距离来看，同热图聚类一样，起始阶段的小米椒与其他样品距离较远，差异较大；第2天和第4天、第12天和第10天、第6天和第8天、第14天和第16天分别距离较近，风味化合物的组成及含量较为相似，说明小米椒在28 ℃恒温发酵过程中，大约是以4 d为一个时间段风味发生较大变化。
图3 小米椒挥发性物质主成分分析
Fig.3 Principal component analysis of volatile components of shimatogarashi
3 结论
本实验以新鲜小米椒为原料，在28 ℃恒温条件下进行发酵，利用HS-SPME-GC-MS技术对不同发酵时间的发酵小米椒进行分析，研究恒温发酵小米椒的主要挥发性成分变化规律。结果表明，小米椒中挥发性成分包括酯、烃、醇、酮、醛、酚、酸、呋喃、含硫类以及含氮类化合物，其中以烃类为主，尤其是香树烯、二甲基十三烷和2-甲基-1-十四（碳）烯。从发酵开始到结束，每隔2 d的小米椒中分别检测到66、62、64、53、64、61、66、70、66种化合物，各类物质在种类上都有不同程度的变化，但整体上趋于平均。在相对含量上，烃类、酯、醇、醛、酚以及呋喃的相对含量在发酵过程中都明显增加，含硫类相对下降。在发酵14 d时，小米椒中风味物质的种类及相对含量均相对较。综合电子鼻PCA分析、GC-MS聚类分析以及感官分析，不同发酵时间的小米椒风味物质存在差异，发酵14d的小米椒香味浓郁、口感协调，风味最佳。
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