金刺梨（Rosa sterilis）又称无籽刺梨，是一种早产、高产、根系发达、生长旺盛的果树，也是一种食药兼用的绿色保健食品，为贵州省特有种系，具有较高的营养和保健价值，有“新山珍”之称，果实中富含维生素C、叶酸、胡萝卜素、超氧化物歧化酶、人体所必需氨基酸等，同时还含有抗白血病的天门冬氨酸，还具有抗氧化能力[1]。金刺梨是具有极大开发利用价值的第三代野生果树，其鲜果的口感比刺梨更佳，香气更浓郁，食之延年益寿，为人体营养、保健佳品[2]。目前，贵州省安顺市对金刺梨进行了大面积的种植栽培，急需对其深加工与新产品开发研究[3]。而近年来对金刺梨的研究多是对比其与刺梨的区别研究为主，付晓慧等[4]研究了刺梨与金刺梨的主要化学成分的区别，得出二者所含的化学成分存在差异是导致口感差异的原因，吴洪娥等[5]对金刺梨和刺梨基本营养成分进行了对比研究，得出主要营养成分维生素C、蛋白质、维生素E、维生素B2及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）都存在差异，另外鲁敏等[8]对金刺梨与刺梨果实中氨基酸组成和含量进行比较研究，也探究了金刺梨与刺梨果实中水解氨基酸与游离氨基酸的组成和含量，结果表明，精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸与鸟氨酸对刺梨果实独特风味的形成有较高贡献，而金刺梨果实中仅天冬氨酸的含量阈值比超过1，形成其鲜味，目前还没有对金刺梨发酵后香气的研究。
本课题组对普通刺梨经过发酵处理工艺处理后，发现酯类、醇类和酸类物质是其特征性风味物质[6]，也有对普通刺梨果渣经过不同菌种发酵后香气成分的分析，发现醇类和酯类是区分不同菌种发酵刺梨果渣的香气的主要因素，经过不同菌种发酵后，刺梨果渣风味改变显著[7]。以上研究都是基于金刺梨与普通刺梨成分的对比研究，而对于金刺梨新产品开发的相关研究几乎空白。因此，本研究以金刺梨为原料，探究金刺梨的游离氨基酸、有机酸和挥发性风味成分经过发酵工艺处理前后的变化，以期为金刺梨发酵产品生产过程中的质量控制提供数据参数，为金刺梨深加工与综合开发利用以及产业的发展提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金刺梨：贵州安顺市贵州大兴农业科技发展有限公司；白糖：市售；纤维素酶（酶活2 000 U/g）：南宁庞博生物科技有限公司提供；发酵剂：贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室自制；硫酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；有机酸标准品（草酸、柠檬酸、苹果酸、L-乳酸、醋酸）（纯度＞99%）：贵州迪大生物科技有限责任公司。
1.2 仪器与设备
L-8800全自动氨基酸分析仪：日本HITICHI公司；HP6890/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；手动固相微萃取装置：美国Supelco公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；SKG-PB-936打浆机：上海达瑞宝公司；BS-210S型电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；GZX-9420MBE鼓风烘箱、BZF-50真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；Millipore-0026型超纯水机：美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 金刺梨发酵方法
取新鲜金刺梨洗净去蒂，按照一份鲜果，二份纯净水打浆混合后，得到金刺梨果浆，此时的果浆作为发酵前的样品，按照果浆总质量的10%添加白糖，搅拌使白糖完全溶化，按照其总质量的0.02%添加纤维素酶，按照其总质量的0.03%添加发酵剂粉末，将发酵剂加入到35～40 ℃的含糖量为10%的糖水中搅拌5～10 min进行活化，混合均匀后将其转至陶瓷坛内，陶瓷坛采用100目纱布封口，在18～25 ℃温度条件下有氧发酵。待发酵3个月后，pH降至3～4，糖度降至4%～5%，产品澄清透明，呈淡黄色，结束发酵，取样作为发酵后的样品。
1.3.2 氨基酸的测定
参照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的测定方法》，准确称取5 mL金刺梨样品溶液，加入6 mol/L盐酸于水解管中，在充氮气状态下封口，将已封口的水解管放在（110±1）℃的恒温干燥箱内，水解22 h后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，用1 mL pH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。准确吸取0.20 mL混合氨基酸标准液溶，用pH 2.2的缓冲液5 mL，此标准稀释液浓度为5.00 nmol/50 μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液的氨基酸含量。
1.3.3 有机酸的测定
采用高效液相色谱法，其中色谱条件：Carbomix H-NP色谱柱（7.80 mm×300 mm，10 μm），柱温：55 ℃，光学部件温度：55℃；室温；流动相：2.50mmol/LH2SO4；流速：0.50mL/min；进样体积：10 μL；标准曲线的绘制：分别取草酸、柠檬酸、苹果酸、L-乳酸、醋酸适量，精密称量，用流动相溶解并定容至5 mL，再分别精密吸取各对照品1 mL进行混合，得到质量浓度分别为160 μg/mL、152.10 μg/mL、161.30 μg/mL、158.40 μg/mL、166.80 μg/mL的草酸、柠檬酸、苹果酸、L-乳酸、醋酸混合对照品溶液，精确量取对照品储备液进行不同比例稀释，制得5个不同质量浓度对照品。精密吸取5 μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制得到有机酸标准曲线；通过保留时间对比法，确定有机酸的出峰顺序，金刺梨酵素样品过0.45 μm的过滤膜后上机检测。
1.3.4 挥发性成分的测定
参照王振斌等[9]对发酵产品的挥发性成分的测定方法进行改进优化，采用固相徽萃取-气质联用（solidphasemicroextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GCMS）技术对金刺梨发酵工艺前后的挥发性成分进行检测。将发酵前后的金刺梨果浆混合均匀后取5 mL，置于10 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有萃取纤维头的手动进样器，在60 ℃的平板加热条件下顶空萃取48 min，热解吸5 min后进样进行GC-MS分析。
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），柱温45 ℃，保持2 min，以5 ℃/min-升温至270 ℃，运行时间72 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；柱前压16.32psi，载气流量1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间3 min。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.60 μA；倍增器电压1 847 V；接口温度280 ℃；质量扫描范围29～500 amu。采用GC-MS工作站软件对照Wiley275和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）17标准数据库进行分析，通过谱库检索和挥发性成分的质谱碎片信息、保留指数、保留时间等进行定性分析；采用面积归一法进行相对含量统计。
1.3.5 数据处理
利用Excel 2018进行标准曲线、相关系数和线性方程计算或模拟应用SPSS 21.0软件进行差异显著性分析，以P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 金刺梨发酵前后氨基酸的变化
氨基酸是蛋白质的主要组成成分，食品中氨基酸的种类和含量是衡量其营养质量和感官呈味的一项重要指标[10]。它可以增强食品的滋味特性来刺激消费者的味觉，也可以间接参与风味的体现[11-12]。参照香气活性值（aroma activity value，OAV）[13]（表示各个呈味物质的含量与其阈值的比），由此确定主要呈味的氨基酸，根据游离呈味氨基酸的分类方法将水解氨基酸分为鲜味氨基酸，甜味氨基酸，芳香味氨基酸，苦味氨基酸四种[14]。氨基酸是不仅是重要的营养物质[15]，而且氨基酸可与多种味觉受体作用，体现出丰富的味感，不同氨基酸组合成为特征性的鲜味[16]。在食品的呈味方面扮演着十分重要的角色[17]。天冬氨酸、谷氨酸为鲜味氨基酸，胱氨酸为芳香氨基酸[18]，组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸为甜味氨基酸，异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸则为苦味氨基酸[19]。
表1 金刺梨发酵前后氨基酸含量变化
Table 1 Changes of amino acid content before and after fermentation of Rosa sterilis
注：“*”为必需氨基酸；“-”为未检出。
由表1可知，金刺梨经发酵工艺前后的水解氨基酸的种类和含量如表1所示，金刺梨发酵前含有17种氨基酸，其中含有3种鲜味氨基酸，7种甜味氨基酸，3种芳香味氨基酸，4种苦味氨基酸，发酵后含有12种氨基酸，其中含有1种鲜味氨基酸，5种甜味氨基酸，3种芳香味氨基酸，3种苦味氨基酸。氨基酸总含量与数量均有所降低，其中鲜味氨基酸含量占总氨基酸的由原来的27.43%降至2.51%，鲜味氨基酸含量占总氨基酸的比例降低了24.92%；但是甜味氨基酸含量占总氨基酸由原来的36.84%上升至42.62%，苦味氨基酸含量占总氨基酸由原来的33.82%上升至41.78%，芳香味氨基酸含量占总氨基酸由原来的1.9%上升至13%；发酵后的甜味氨基酸，苦味氨基酸，芳香味氨基酸含量占总氨基酸的比例分别提高了5.78%，7.96%，11.1%。苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，当其含量低于呈味阈值时，可增强其它呈味氨基酸的鲜味和甜味[20]。发酵后未检测出异亮氨酸，可能是被乳酸菌酵解并形成了挥发性风味物质。发酵后氨基酸含量减少，可能是因为氨基酸在微生物和酶的作用下形成α-酮酸，然后被脱羧而转化为乙醛，接着被脱氢形成乙醇或羧酸[21]，最终转化为对整体香味有益的芳香类酯类物质。
2.2 金刺梨发酵工艺处理前后有机酸的变化
采用高效液相色谱法，通过与照品保留时间对比，得到的有机酸依次为草酸、柠檬酸、苹果酸、L-乳酸、醋酸。金刺梨发酵前，金刺梨发酵后以及对照品的高效液相图谱如图1所示，经过一元线性回归得出各有机酸标准曲线回归方程如表2所示，结果表明各有机酸在各自进样量范围内线性关系良好。
有机酸酸类是形成酯类的前体物质，它可以构成其他香味物质，其对金刺梨酵素风味的重要性仅次于酯类。同时，有机酸是重要的味感物质，它可使得酵素口感丰满。采用外标法测定其有机酸种类及含量，结果见表3。
从表3中可以看出，金刺梨发酵前后有机酸种类和含量均发生了显著变化，发酵后新增的有机酸包括苹果酸，乳酸，醋酸三种，另外原有的柠檬酸含量发酵后是发酵前的3.42倍，苹果酸含量增长7.51倍。分析金刺梨酵素后的有机酸组成可知，醋酸含量最高，达到17 477.80 mg/kg，这与发酵过程中微生物的作用密切相关，醋酸菌以酒精为基质，在有氧条件下，将乙醇脱氢生成乙醛，再生成醋酸，醋酸作为金刺梨酵素的主体物质。其次，柠檬酸含量较高，这使得金刺梨酵素的酸味长，口感好[22]。苹果酸、乳酸具有缓冲作用，并融合和协调金刺梨酵素中的糖分、氨基酸和香气成分，使得金刺梨酵素的酸味柔和，味道醇和。草酸和L-乳酸等含量相对较少，是金刺梨酵素中辅助酸味的有机酸，这形成了金刺梨酵素丰富的酸味味感。金刺梨酵素中丰富的有机酸对其营养价值有重要贡献，研究表明有机酸对人体肠道微生态的调节具有重要作用[23]，从风味角度分析，金刺梨酵素中有机酸以醋酸为主，配合其他种类的有机酸的辅助，使金刺梨酵素产品味觉持久性得以延伸，口感饱和度柔和鲜爽、体现出丰满、爽快、持久和层次感。
图1 金刺梨发酵前（a）、发酵后（b）、对照品（c）的有机酸含量测定HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid contents detection of Rosa sterilis before fermentation (a),after fermentation (b)and standards (c)
1.草酸；2.柠檬酸；3.苹果酸；4.L-乳酸；5.醋酸。
表2 五种有机酸的线性关系考察结果
Table 2 Results of linear relationship of five organic acids
表3 金刺梨发酵前后有机酸含量
Table 3 Organic acids contents of Rosa sterilis before and after fermentation
注：“-”表示未检出。
2.3 金刺梨发酵工艺处理前后挥发性成分的变化
图2 金刺梨发酵前（A）和发酵后（B）挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components before (A) and after (B) fermentation of Rosa sterilis analysis by GC-MS
表4 金刺梨发酵前后挥发性化合物检测结果
Table 4 Determination results of volatile compounds in Rosa sterilis before and after fermentation
续表
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注：“-”为未检出。
从表4可知，金刺梨发酵前后的挥发性香气成分在种类和含量上发生了显著性变化，金刺梨发酵前检出98种挥发性成分，包括醇类（14种）相对百分含量占22.22%，醛类（14种）相对百分含量占2.39%，酯类（20种）相对百分含量占4.11%，酮类（12种）相对百分含量占1.13%，酸类（11种）相对百分含量占50.74%，烷烯烃类（17种）相对百分含量占2.31%，其他类（10种）相对百分含量占0.73%，金刺梨发酵后检出95种挥发性成分，包括醇类（15种）相对百分含量占46.02%，醛类（6种）相对百分含量占0.65%，酯类（36种）相对百分含量占36.63%，酮类（6种）相对百分含量占0.20%，酸类（9种）相对百分含量占2.66%，烷烯烃类（14种）相对百分含量占0.90%，其他类（9种）相对百分含量占3.80%。由以上数据可知，金刺梨发酵处理以后，含量发生显著变化的有酸类、醇类、酯类；其中醇类和酯类的相对含量百分比分别增加了23.79%，32.52%，而酸类、醛类和酮类相对含量百分比分别降低了48.08%、1.73%、0.93%。醇类是酵母菌发酵的主要代谢产物，风味方面多呈现出清新的花草香气，其中乙醇含量显著增加，乙醇被赋予苹果甜香的风味特征[24]，可有效的增加金刺梨酵素的香甜风味。酯类化合物是芳香风味的代表，发酵后，乙酸乙酯、己酸乙酯的含量明显增加，而乙酸乙酯被赋予果香和酯香属性[25]；己酸乙酯具有水果香味，具有曲香和菠萝香型香气[26]；显著提升了金刺梨酵素的芳香风味。同时产生了新的芳香酯类化合物，如具有苹果香味[27]的顺式-4-辛烯酸乙酯、带有明显的玫瑰、橙子香气[28]的壬醛酯，以及对刺激性味感具有缓冲作用的乳酸乙酯[29]。其中含量显著降低的是酸类和醛类化合物，酸类化合物中己酸和辛酸含量显著降低，相对百分含量分别32.2%、15.2%降至0.95%、0.72%，有研究表明己酸作为己酸乙酯的前提物质，是浓香型白酒中最重要的香气成分[30]，低含量的己酸在水果中表现出一定的芳香味，但是高浓度的己酸会导致刺激性酸味[31]，可知己酸经过发酵后转化为具有芳香风味的己酸乙酯，醛类化合物经发酵工艺后也明显降低，同样高浓度的醛类物质会带来异味[32]，但经发酵后，醛类物质因不稳定，被还原为醇或者氧化为酸[33]。
3 结论
本研究通过对金刺梨发酵前后的呈味呈香物质的变化进行分析研究。可知金刺梨经过酵素化处理后，氨基酸总含量与数量均有所降低，但发酵后的甜味氨基酸，苦味氨基酸，芳香味氨基酸含量占总氨基酸的比例相对提高；有机酸含量和数量均增加，发酵处理后新增的有机酸包括苹果酸、乳酸、醋酸三种，新产生的有机酸使金刺梨酵素味觉持久性得以延伸，口感饱和度柔和鲜爽、体现出丰满、爽快、持久和层次感；挥发性风味物质变化显著，其中醇类和酯类的相对含量百分比的增加赋予了金刺梨酵素特有的果香和酯香属性，而酸类和醛类酮类相对含量的降低缓解了金刺梨因高浓度的酸类和醛类而导致的刺激性的酸味和不愉悦的异味。以上结果更有力的为金刺梨在新产品开发中利用发酵工艺的可行性提供了数据支撑，后期将进一步的从功能功效和营养吸收等方面分析发酵工艺在果蔬产品开发中的优势，为酵素产业的发展提供理论支撑。
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