水果烈酒又叫水果蒸馏酒，是指以新鲜水果或果汁为原料，经过发酵、蒸馏、贮存而成的饮料酒[1]。影响蒸馏酒品质的主要因素有酿酒原料的地理产区、原料品种、酵母菌种、蒸馏工艺等，其中最主要的因素之一是酿酒酵母的选择，因为酵母菌可以将葡萄果实内的大部分糖转化为酒精和二氧化碳，并且在发酵期间生成甘油、高级醇、酯类、醛类等香气物质，可以说酵母菌是葡萄酒的灵魂[2-5]。目前为止，已发现的存在于葡萄果实、葡萄醪及葡萄酒中的酵母菌有120种，属于24个属，常见的有酵母属、梅奇酵母属、类酵母属、结合酵母属等，几乎遍及酵母的主要属种[6]。
山葡萄北国蓝，原代号88100，由中国农业科学院特产研究所选育，于2015年通过吉林省农作物品种审定，并命名为“北国蓝”[7]。北国蓝作为东北地区主栽的山葡萄品种之一，具有抗寒抗病性强、丰产稳产性高的特点[8]。北国蓝浆果具有高酸、高单宁、低糖、弱香气的特点，使得单品种酿造的葡萄酒也具有酸高、糖低的特性，很少直接饮用，平时多用来调酸调色，但这正好符合葡萄烈酒对原料的要求[9-10]。
本实验选用北国蓝作为试验材料，通过分析比较不同酵母发酵的蒸馏酒香气成分的种类和含量，从而得到适合酿造山葡萄烈酒的酿酒酵母，对适合酿造山葡萄蒸馏酒的酵母菌进行初步探讨，有利于山葡萄蒸馏酒的开拓，并为山葡萄蒸馏酒的后续研究提供了一些参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山葡萄北国蓝：吉林省吉林市左家镇山葡萄试验园，种植株行距为1.0 m×2.5 m，篱架式，5年生。
8种安琪活性干酵母（CEC01、BV818、RV171、VIC、MST、ADT、VF、OFR）：安琪酵母股份有限公司。
硫酸（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠（分析纯）：北京化工厂；蒽酮、邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；葡萄糖（分析纯）：广州金华大化学试剂有限公司；4-甲基-2-戊醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
Cary 60 UV-Vis 紫外分光光度计：安捷伦科技有限公司；PAL-06型手持折光仪：日本ATAGO公司；ALB-124电子分析天平：德国赛多利斯公司；FlavourSpec 
风味分析仪：德国GAS公司；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；FD-1C-50真空冷冻干燥箱：北京博医康实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 山葡萄北国蓝蒸馏酒酿造操作要点
采样：结合北国蓝的成熟期与2018年吉林省吉林市左家镇的气候条件，选择在9月14日采样并进行酿酒试验，为了保证采样具有代表性，在北国蓝试验区选40棵树，在每棵葡萄树的上、中、下随机摘取穗葡萄，取样总量为80 kg。
酿造：采回的葡萄挑去病果、烂果后，留3穗葡萄考种，其他进行人工去梗、破碎，加入8种安琪活性干酵母（250 mg/L）均分于8个20L的玻璃发酵罐中发酵7 d，发酵温度设为18℃。发酵结束后，留取200 mL样品，测定葡萄酒的各理化指标。
蒸馏：发酵结束后的葡萄醪用12 L的帝伯仕小型实验室用蒸馏器进行蒸馏，流程如下：
陈酿：将装瓶的蒸馏酒（澄清透明，酒精度为44%vol），放置在10～20 ℃、恒湿（50%）、阴暗条件下密封保存6个月，然后进行成分检测分析。
1.3.2 理化指标的测定方法
葡萄果实、葡萄酒及蒸馏酒酒的理化指标：参照参考文献[11-12]的方法测定。
1.3.3 香气成分的测定方法
采用顶空-气相色谱法对山葡萄北国蓝蒸馏酒的挥发性香气成分进行测定[13]：取1 mL酒样，每个样重复3次，置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL 20 mg/L 的4-甲基-2-戊醇（内标），60 ℃孵育10 min后进样。内标法定量分析。
1.3.4 数据处理
运用SAS数据分析软件，进行方差分析、主成分分析。
2 结果与分析
2.1 不同酿酒酵母对蒸馏酒可溶性固形物的影响
图1 不同酿酒酵母对山葡萄北国蓝蒸馏酒可溶性固形物的影响
Fig.1 Effect of different Saccharomyces cerevisiae on the soluble solid contents of Vitis amurensis Beiguolan distilled spirits
由图1可知，发酵期间，葡萄醪的可溶性固形物都呈下降趋势，下降速率因酵母不同而有差异。酵母CEC01起发最快，而且可溶性固形物下降得最快，ADT次之，但在第3天，ADT的可溶性固形物下降速率高于CEC01，BV818的下降速率仅次于前两者，其次是RV171、MST、VF、VIC，OFR的下降速率是最慢的。发酵结束时，RV171的残糖最高，为7.1%，CEC01最低，为6.3%。总体来看，酵母CEC01发酵速度快，发酵彻底；酵母ADT起发较快，发酵速率最快，发酵彻底。
2.2 不同酿酒酵母对蒸馏酒理化指标的影响
表1 不同酿酒酵母对山葡萄北国蓝蒸馏酒的理化指标比较
Table 1 Comparison of physicochemical indexes between Vitis amurensis Beiguolan distilled spirits by different Saccharomyces cerevisiae
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表1可知，用8种不同的酵母发酵的蒸馏酒还原糖范围为1.38～2.23 g/L，发酵完成，其中用酵母RV171发酵的蒸馏酒还原糖为（2.23±0.26）g/L，显著高于其他7种酵母（P＜0.05），用MST发酵蒸馏酒的还原糖为（1.38±0.40）g/L，显著低于其他酵母（P＜0.05）。
用8种不同酵母发酵的蒸馏酒总酸范围为16.43～18.09 g/L，均低于原料山葡萄北国蓝浆果的总酸（23.45 g/L），说明8种酵母均有一定的降酸能力。其中用酵母ADT发酵的蒸馏酒总酸为（18.09±0.11）g/L，显著高于其他7种酵母（P＜0.05），其次是VF、CEC01、BV818，OFR发酵的蒸馏酒总酸为（16.45±0.10）g/L，显著低于其他酵母（P＜0.05）。
用8种不同的酵母菌发酵的蒸馏酒酒精度为9.65%vol～9.80%vol，用酵母MST发酵的蒸馏酒酒精度为9.80%vol，发酵最彻底，产酒能力显著优于其他酵母（P＜0.05），其次是CEC01，酵母BV818发酵的蒸馏酒酒精度最低，为9.65%vol。
2.3 不同酿酒酵母对蒸馏酒挥发性香气成分的影响
2.3.1 不同酿酒酵母发酵的蒸馏酒香气成分的定性定量分析
表2 8种酿酒酵母发酵的蒸馏酒样中香气成分的种类和含量
Table 2 Types and contents of aroma components in distilled spirit samples fermented by 8 different Saccharomyces cerevisiae
由表2可知，用该方法共检测到29种挥发性香气物质，包括16种酯类、8种醇类、2种醛类和3种酮类。醇类和酯类气组分含量高，占总香气成分含量的91.59%～93.4%，这与前人所研究的主要香气成分占比相符合[14-15]。酵母CEC01发酵的蒸馏酒中挥发性物质含量最高，为16 394.235 μg/L，其次为酵母VF（16 163.22 μg/L）、ADT（15 576.32 μg/L）、MST（14 970.34 μg/L）、OFR（14 914.04 μg/L），酵母BV818发酵的蒸馏酒中挥发性物质总含量最低，为13 783.04 μg/L。
该实验中，酯类物质占香气总含量的比例为23.2%～36.96%，主要在发酵和蒸馏过中醇类与有机酸通过酯化作用生成，具有果香和花香，是葡萄酒中最活跃的物质[16]。酒样中共检16种酯类物质，其中乙酯类10种，己酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯含量较高，且具有苹果、香蕉、菠萝等果香，是蒸馏酒香气成分组成中有不可或缺的作用[17]；有6种乙酸酯，其中乙酸异戊酯为蒸馏酒提供香蕉香气且含量明显高于其他几种。8种类型酿酒酵母发酵的山葡萄蒸馏酒中，酵母VF发酵的蒸馏酒中酯类物质含量最高，为5 974.699 μg/L，占香气总含量的36.96%，其次是酵母CEC01（5426.388μg/L）、ADT（4 627.19 μg/L）、MST（4 293.878 μg/L），含量最低的是酵母VIC（3 202.575 μg/L）。
醇类主要来自于发酵过程中酵母代谢产生、其次也来源于糖苷类前体和酯类分解等[18]。该实验共检测出醇类物质8种，占总香气含量的54.63%～70.85%，含量最高且具有特殊香味，是烈酒香气成分中必不可少的。不同酿酒酵母发酵的蒸馏酒醇类物质的种类相同、含量各异，8种蒸馏酒中异戊醇、2-甲基-1-丙醇、D-正己醇含量最多，其中异戊醇具有青草、吐司味，是酵母菌代谢的产物；2-甲基-1-丙醇具有麦芽香，在蒸馏酒香气中有重要贡献[19]；D-正己醇赋予酒青草香、吐司味，且高级醇是某些酯类物质的前体物质，对呈香具有重要作用，将会提高酒的感官品质。三者的含量占总醇类含量的72.13%～78.55%，是蒸馏酒中主要的醇类呈香物质。其中酵母ADT发酵的蒸馏酒中异戊醇和D-正己醇的含量（分别为1 014.88 μg/L、4 670.382 μg/L）高于其他几种酵母，其次是酵母CEC01（分别为4 601.746 μg/L、991.411 μg/L）；酵母OFR发酵的蒸馏酒中2-甲基-1-丙醇的含量最高，为1708.929μg/L，其次是酵母CEC01（1671.072μg/L）、ADT（1 634.422 μg/L）。
山葡萄蒸馏酒中除了前面所述的两大类香气物质外，还检测到少量其他物质（如糠醛、丙酮、2,3-丁二酮等）。山葡萄蒸馏酒中的醛酮类物质的来源有以下几种：来源于水果本身、产生于蒸馏酒酿造的整个过程、在陈酿时由其他物质转化而来，这些物质对蒸馏酒的风味有着极重要的作用，主要提供坚果味和过熟的苹果味，是其前香的重要组成部分[20-21]。共检测出5种醛酮类物质，占总香气含量的6.56%～8.33%，其中糠醛为酒体提供苦杏仁味，2,3-丁二酮提供奶油味。酵母ADT发酵的蒸馏酒中糠醛含量最高（140.924μg/L），其次是酵母MST（127.138μg/L）；酵母CEC01发酵的蒸馏酒中酮类物质含量最高（960.434 μg/L），其次是酵母VIC（958.014 μg/L）。
2.3.2 不同酿酒酵母发酵的蒸馏酒香气成分的主成分分析
仅凭香气成分的含量进行分析具有一定的片面性，香气成分之间的相互作用对葡萄蒸馏酒香气品质的影响考虑的不够充分全面，为了进一步验证不同品种葡萄蒸馏酒的香气品质，本研究参考了沈静等[22]的主成分建模方法。首先将检测到的29种香气成分分为酯类（X1）、醇类（X2）、醛类（X3）、酮类（X4）4个类型，以8种不同酿酒酵母发酵的蒸馏酒的4类挥发性香气成分为指标构成8×4的矩阵，使用SAS软件进行分析。不同酵母发酵的蒸馏酒中4类香气成分的特征值及方差贡献率见表3，主成分因子载荷矩阵见表4。
表3 不同酿酒酵母发酵的蒸馏酒中4类香气物质的特征值
Table 3 Characteristics value of 4 types of volatile aroma components in distilled spirit with different Saccharomyces cerevisiae
表4 主成分因子载荷矩阵
Table 4 Loading matrix of principal components factors
由表3可知，前3个主成分的累计方差贡献率达到97.56%，可以有效解释所有变量的信息，故可以将这3个主成分作为香气数据分析的有效成分。同时根据3个主成分的特征向量，可以用Z1、Z2、Z3这3个新的综合指标来代替5种香气成分，进行综合评价，以下是8个不同酵母发酵的蒸馏酒香气物质的线性关系：
主成分Z1、Z2、Z3从不同方面反映了8种不同蒸馏酒的香气成分，但若只采用其一，则难以对蒸馏酒进行综合评价。因此，可用Z1、Z2、Z3在方差贡献率作为权重数，计算主成分因子的权重，公式如下：
由表4计算可知，主成分因子1、2、3的权重分别是0.415、0.393、0.192，然后对Z1、Z2、Z3加权，得到不同酵母菌发酵的蒸馏酒的挥发性香气成分的综合得分（Z），公式如下：
对8种不同酵母发酵的蒸馏酒进行综合分析，结果见表5。
表5 主成分的综合得分
Table 5 Composite score of principal components
由表5可知，第1主成分综合得分最高的是酵母ADT发酵的蒸馏酒（1.707 09），第2主成分得分前两位的分别是酵母CEC01和RV171发酵的蒸馏酒（1.369 33和0.358 89），第3主成分得分最高的是酵母VIC发酵的蒸馏酒（1.496 09）。在香气综合得分中，酵母CEC01发酵的蒸馏酒得分最高（0.426 012），ADT发酵的蒸馏酒（0.410 39）稍低于酵母CEC01，其次是酵母MST（0.338 028）、BV818（0.250 197）、VIC（0.011 313），这5种酒样的综合得分＞0，说明其整体香气质量在8种酒样的平均水平之上。相比较而言，酵母CEC01、ADT发酵的蒸馏酒品质较好，这与对香气成分定性定量分析的结果相差不大。
3 结论
优质的菌株是果酒加工的核心要素之一，是保证酒质与产量的关键。本实验主要进行了酿酒酵母的筛选，目的是获得一种或几种适合山葡萄发酵的、发酵能力强且酒香浓郁的酿酒酵母。在发酵过程中，酵母CEC01起发最快，发酵速率快；酵母ADT起发较快，发酵速率最快；发酵完成后，酵母MST的发酵蒸馏酒酒精度最高，发酵最彻底，产酒能力优于其他酵母（P＜0.05），其次是酵母CEC01；酵母CEC01发酵的山葡萄蒸馏酒中挥发性物质的含量最高，其次是酵母VF、ADT；主成分建模分析得分最高的是酵母CEC01，其次是酵母ADT、MST。结果表明，酵母CEC01、ADT发酵能力强，产酒率高，且蒸馏酒的酒香浓郁、品质较好，适合酿造山葡萄蒸馏酒。
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