大蒜（Allium sativum L.）为多年生百合科葱属植物蒜的地下鳞茎，起源于中亚和地中海地区，汉朝时期被引种到中国，9世纪传入日本和南亚地区，16世纪前叶在非洲和南美洲出现栽培，18世纪传入北美洲。大蒜早在《本草纲目》中就有记载：大蒜“通五脏，达诸窍，去寒湿，辟邪恶，消痈肿。”[1]。现代研究发现，大蒜主要有抵抗癌症、消除肿瘤[2]、抗氧化、清除自由基、降低血糖、预防血栓[3]、保护肝脏及调节免疫力和提高身体免疫功能[4]的作用，此外还有减肥、美容、戒烟等功效[5]。大蒜提取物主要成分有蒜氨酸和环蒜氨酸、大蒜挥发油、蒜素、有机锗、微量元素硒和维生素[6]。柴惠等[7]研究发现，大蒜提取物对心血管疾病具有抑制作用；方欢等[8]研究发现，大蒜提取物可以增强小鼠的免疫能力。
肝脏是人体最大的腺体，其主要功能包括碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢以及胆汁的分泌[9]。许多化学药品、药物、异种生物、感染和酒精中毒等会诱发肝功能障碍。肝功能不全会导致肝硬化、肝炎、肝肥大、癌症和肝衰竭[10]，严重的可能危害人类健康，因此化学物质引起的肝损伤应引起广大人民的重视。
国内外研究肝损伤的动物实验模型主要有化学性肝损伤模型、免疫性肝损伤模型、药物性肝损伤模型、酒精性肝损伤模型和缺血再灌注肝损伤模型[11]。各种肝损伤模型使用的致病物质也不相同，化学性肝损伤常使用四氯化碳（CCl4）[12]、D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）[13]等，免疫性肝损伤常使用刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）[14]、卡介苗（bacille calmette-guerin，BCG）联合细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[15]和D-GalN联合LPS[16]等，药物性肝损伤常用乙酰氨基酚（acetaminophen，AP）和异烟肼（isonicotinyl hydrazide，INH）联合利福平（rifampicin，RIF）[17]等建立模型。
国内已有报道，大蒜多糖和蒜氨酸都对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠有保护作用[18-19]，但关于大蒜提取物保肝作用的研究鲜见报道。通常制备大蒜提取物时需要经过醇沉处理，虽然可以将淀粉和蛋白质除掉，但也将大蒜多糖这一有效成分一同去除，使大蒜提取物的保肝效果减弱，故本研究制备大蒜提取物时不经过醇沉操作，最大程度保留大蒜保肝有效成分，以提高大蒜提取物的保肝效果。本研究以大蒜提取物为研究对象，使用四氯化碳饲喂小鼠建立化学性肝损伤模型，研究大蒜提取物对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠的保护作用，为后续对大蒜提取物保肝作用的研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
健康雌雄美国癌症研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（无特定病原（specificpathogen free，SPF）级，体质量18～22 g）：北京斯贝福生物技术有限公司；四氯化碳（分析纯）：广州化学试剂厂；水飞蓟宾胶囊：天津天士力制药股份有限公司；10%多聚甲醛溶液（paraformaldehyde，PFA）：上海源叶生物技术有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脱氢酶（lacticdehydrogenase，LDH）、还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、胆碱酯酶（cholinesterase，CHE）、白蛋白（albumin，ALB）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；总蛋白（total protein，TP）测定试剂盒：睿信生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Epoch酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；1580R高速离心机：中国香港基因有限公司；F6配4GZL手持式均质乳化机：金华市华海科教仪器厂；SHB-111A循环水式真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；R-205型旋转蒸发仪：上海申顺生物科技有限公司；M1-211A型微波炉：美的集团有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大蒜提取物的制备
精确称量30 g去皮的大蒜瓣，使用微波炉进行微波灭酶，微波功率400 W，微波时间3 min。加入4倍体积的蒸馏水匀浆3 min，搅拌提取10 min，3 500 r/min离心15 min，上层清液使用四层纱布和布氏漏斗真空抽滤后，收集真空抽滤瓶中的滤液。大蒜提取物中蒜氨酸含量为3%，总糖含量为38%。
1.3.2 化学性肝损伤模型的建立
ICR小鼠共76只，雌雄各半，适应性喂养3 d后随机分为6组，即空白对照组、模型组、大蒜提取物低、中、高剂量组、阳性对照组，每组12只动物，灌胃体积0.1 mL/10 g体质量，空白组与模型组均灌胃纯水，低、中、高剂量组灌胃大蒜提取物的剂量分别为120 mg/（kg·d）、440 mg/（kg·d）、1 520 mg/（kg·d），阳性对照组灌胃水飞蓟宾，剂量为70 mg/（kg·d）。连续给药14 d，期间各组小鼠自由饮水进食，每周称量一次体质量，并调整灌胃剂量，第14天建立四氯化碳肝损伤模型。以0.1 mL/10 g体质量的灌胃剂量给予模型组、大蒜提取物低、中、高剂量组、阳性对照组0.1%四氯化碳食用油溶液，空白组灌胃等剂量食用油。造模后禁食不禁水16 h，用眼球取血的方式收集小鼠血液，3 000 r/min离心10 min两次，分离血清。取肝脏相同部分，加入9倍体积生理盐水，冰水浴匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液待测。
1.3.3 小鼠血清及肝脏生化指标测定
采用试剂盒测定小鼠血清及肝脏中总蛋白、白蛋白、谷胱甘肽的含量和小鼠血清及肝脏中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、肝脏中胆碱酯酶的活力。
1.3.4 统计学分析方法
采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0进行数据的统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）检验进行组间差异的显著性分析。
2 结果与分析
2.1 小鼠血清和肝脏中AST、ALT和LDH活力测定结果
2.1.1 小鼠血清中AST、ALT和LDH活力测定结果
AST、ALT和LDH的活力可反映肝脏受损情况，这3种酶的活力越高表明肝脏损伤程度越高[20]。小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的测定结果见表1。
表1 大蒜提取物对肝损伤小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶活性的影响
Table 1 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in serum of mice with liver injury
注：与模型组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）；与空白对照组比较，“#”表示差异显著（P＜0.05），“##”表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
由表1可知，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中AST、ALT和LDH活力极显著升高（P＜0.01），说明四氯化碳对小鼠肝脏造成了损伤，成功建立了肝损伤小鼠模型。与模型组比较，各给药组小鼠血清中AST、ALT和LDH活力均降低，说明大蒜提取物3个剂量组可不同程度地抑制肝损伤小鼠血清中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，对于小鼠血清中AST活力，高剂量组作用极显著（P＜0.01）；对于小鼠血清中ALT活力，低剂量组作用显著（P＜0.05），中剂量组和高剂量组的作用极显著（P＜0.01）。
2.1.2 小鼠肝脏中AST、ALT和LDH活力测定结果
小鼠肝脏中AST、ALT和LDH活力的测定结果见表2。
表2 大蒜提取物对肝损伤小鼠肝脏中天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶活性的影响
Table 2 Effect of garlic extract on aspartate transaminase，alanine transaminase and lactic dehydrogenase activity in liver of mice with liver injury
由表2可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中AST、ALT和LDH活力极显著升高（P＜0.01），说明四氯化碳对小鼠肝脏造成了损伤，成功建立了肝损伤小鼠模型。与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中AST、ALT和LDH活力均降低，说明大蒜提取物3个剂量组可不同程度地抑制肝损伤小鼠肝脏中AST、ALT和LDH活力的不正常升高，其中，对于小鼠肝脏中AST活力，中剂量组和高剂量组的作用显著（P＜0.05）；对于小鼠肝脏中ALT活力，低剂量组的作用显著（P＜0.05），中剂量组和高剂量组的作用极显著（P＜0.01）；对于小鼠肝脏中LDH活力，3个剂量组的作用都极显著（P＜0.01）。阳性对照组也有极显著作用（P＜0.01）。KODAI S等[21]研究表明，蒜氨酸可以抑制四氯化碳所致的小鼠ALT和LDH活力的不正常升高，其结果与本研究一致，说明大蒜提取物对肝细胞的损伤确有保护作用。
2.2 小鼠血清和肝脏中ALB、TP和GSH含量测定结果
2.2.1 小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的测定结果
肝的储备功能可以由血清白蛋白的含量来反映，血清白蛋白的含量能表示肝脏的病变程度[22]，蛋白含量的水平能反映肝脏的合成能力，GSH的含量可以衡量机体抵抗氧化的能力[23]。小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的测定结果见表3。
表3 大蒜提取物对肝损伤小鼠血清中白蛋白、总蛋白、谷胱甘肽含量的影响
Table 3 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in serum of mice with liver injury
由表3可知，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中ALB、TP和GSH含量极显著降低（P＜0.01），说明四氯化碳对小鼠肝脏造成了损伤，成功建立了肝损伤小鼠模型。与模型组比较，各给药组小鼠血清中ALB、TP和GSH含量均升高，说明大蒜提取物3个剂量组可不同程度地抑制肝损伤小鼠血清中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，对于小鼠血清中ALB含量，3个剂量组的作用都极显著（P＜0.01）；对于小鼠血清中TP含量，高剂量组的作用显著（P＜0.05）；对于小鼠血清中GSH的含量，高剂量组的作用显著（P＜0.05）。
2.2.2 小鼠肝脏中ALB、TP和GSH含量的测定结果
小鼠肝脏中ALB、TP和GSH含量的测定结果见表4。
表4 大蒜提取物对肝损伤小鼠肝脏中白蛋白、总蛋白、谷胱甘肽含量的
影响
Table 4 Effect of garlic extract on albumin，total protein and glutathione content in liver of mice with liver injury
由表4可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中ALB、TP和GSH含量均极显著降低（P＜0.01），说明四氯化碳对小鼠肝脏造成了损伤，成功建立了肝损伤小鼠模型。与模型组比较，各给药组小鼠肝脏ALB、TP和GSH含量均升高，说明大蒜提取物3个剂量组可不同程度地抑制肝损伤小鼠肝脏中ALB、TP和GSH含量的不正常降低。其中，对于小鼠肝脏中ALB含量，高剂量组的作用极显著（P＜0.01）；对于小鼠肝脏中TP含量，中剂量组和高剂量组的作用显著（P＜0.05）；对于小鼠肝脏中GSH含量，中剂量组和高剂量组的作用均极显著（P＜0.01）。
刘静[24]研究表明，连翘可以抑制四氯化碳所致的小鼠TP、ALB和GSH含量的不正常降低，从而达到保护肝脏的作用，其结果与本研究一致。说明大蒜提取物不仅在一定程度上可以修复损伤引起的肝脏合成能力下降[25]，还可以增加小鼠肝细胞抵抗氧化的能力，其机制可能是大蒜提取物诱导GSH的含量上升，为谷胱甘肽过氧化酶提供还原剂，使肝细胞膜对氧自由基的耐受性增加，从而保护肝细胞膜，使肝细胞膜稳定性增加、肝酶活降低，从而达到保护肝脏的作用[26]。
2.3 小鼠肝脏中CHE活性测定结果
CHE又称假胆碱酯酶或非特异性胆碱酯酶，和白蛋白相比，胆碱酯酶半衰期短，且合成后立即释放入血，其活性降低程度与肝细胞受损程度相一致，肝病越严重，胆碱酯酶下降的幅度越大，甚至胆碱酯酶比白蛋白在反映肝脏合成功能方面还要灵敏[27]。小鼠肝脏中CHE活性测定结果见表5。
表5 大蒜提取物对肝损伤小鼠肝脏中胆碱酯酶活性的影响
Table 5 Effect of garlic extract on choline esterase activity in liver of mice with liver injury
由表5可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏CHE活力极显著降低（P＜0.01），说明四氯化碳对小鼠肝脏造成了损伤，成功建立了肝损伤小鼠模型。与模型组比较，各给药组小鼠肝脏CHE活力均升高，说明大蒜提取物3个剂量组可不同程度地抑制肝损伤小鼠肝脏中CHE活力的不正常降低。其中，高剂量组的作用极显著（P＜0.01）。
从小鼠肝脏CHE测定结果可知，大蒜提取物能显著抑制四氯化碳所致的小鼠CHE活力的不正常降低，说明大蒜提取物能够使受损肝脏的合成能力获得改善，其机制可能是大蒜提取物可以增加细胞抵抗氧化的能力，以缓解肝脏受到自由基的损伤，从而达到抑制四氯化碳损伤肝脏的作用[28]。
3 结论
大蒜提取物可以抑制四氯化碳诱导肝损伤小鼠血液及肝脏中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）活力不正常升高，并抑制总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷胱甘肽（GSH）含量及胆碱酯酶（CHE）活力不正常降低，说明大蒜提取物可以通过提高肝细胞抗氧化能力，改善肝脏合成能力达到对四氯化碳诱导的肝损伤具有保护作用。
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