海洋被誉为资源能源宝库[1]。海藻（algae）在生物资源中扮演着重要的角色。全球海藻共有3万多种，人类大量开发利用的藻主要有四类——红藻（Rhodophycea）、褐藻（Phaeophyceae）、绿藻（Chlorophyta）、蓝藻（Cyanophyta）[2]。海藻中含有丰富的活性物质，这些生物活性物质主要有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、免疫调节、抗辐射、抗衰老、抗氧化等作用[3]。
海藻是一种具有绿色保健功效的天然食材，近几年来，有很多对海藻提取物在食品中应用的报道[4-5]。研究发现，裙带菜海藻在烹饪面食时可以明显改善部分面食的口感[6]，香肠中加入海藻能够改善食用纤维含量，使香肠低钠高钙；加入裙带菜海藻可以增加矿物质含量，钠钾比无明显影响[7-8]。RAO P V等[9]对不同地方食用的越南紫菜进行分析，得出越南海带中矿物成分相比蔬菜和其他食用海藻均较高且含有益寿饮食物质。海藻中还能够提取出有保健功能及疗效的活性物质，目前海藻中抗病毒、抗肿瘤和治疗心血管疾病这3个方面的活性物质被重点关注[10-11]。ARAU′JO I W F D等[12]从新月藻中分离出具有显著镇痛和抗炎作用的硫酸多糖，且该物质在对小鼠使用时没有显示任何毒性迹象。KWON H J等[13]发现小珊瑚藻的乙醇提取物对人体宫颈腺癌细胞株和子宫颈癌传代细胞有治疗作用。另外红藻中的卡拉胶、琼胶和褐藻中的褐藻胶三种凝胶，已经作为凝胶剂、乳化剂和增稠剂等应用在化妆品中；巨藻因其能促进细胞再生、保持皮肤健康而出名；来源于褐藻的岩藻多糖和岩藻黄素在市场上也是常见的海藻护肤产品[14-16]。
红藻是很古老的藻类，江蓠（Gracilaria）就是红藻中的一员。江蓠属于江蓠科、江蓠属，由于江蓠的生长分布非常广，江蓠的种类也非常的丰富[17]，该研究的江蓠品种为细基江篱（Gracilaria tenuistipitata）；麒麟菜（Eucheuma muricatum）分为刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）和异枝麒麟菜（E.striatum），是红藻门红翎科植物全藻体，别名鸡胶、鸡脚菜等。藻体形态多为分枝状细圆柱体，具刺状或者锥形实体，生长于有珊瑚礁的岩石上[18]；石花菜（Gelidium amansii）别名洋菜、燕菜精、石生花等，具有高食疗高经济价值。石花菜在植物学上为红藻门[19-20]，大部分呈现紫色偏红，不过因为生长环境以及自然条件的不同，有的也会呈现深红色或者暗紫色[21]。小球藻（Chlorella vulga）属于单细胞绿藻，是球形单细胞淡水藻类的一种，直径约为3～8 μm，广泛分布于淡水水域，种类也最多[22]。它容易于培养，除了能利用光能自养，还能在异养条件下进行生长、繁殖，其应用及食用价值很高[23]。
本研究着重于红藻类中的江篱（Gracilaria）、刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）、异枝麒麟菜（E.striatum）、石花菜（Gelidium amansii）以及绿藻类中的小球藻（Chlorella vulga）五株不同藻种的次级代谢物质筛选；通过薄层层析色谱（thin layer chromatography，TLC），高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析探讨五株海藻次级代谢产物的丰富度，为海藻在食品、药物和化妆品上的后续研发提供有利的实验基础保障。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
江篱（Gracilaria）、刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）、异枝麒麟菜（E.striatum）：绿新集团；石花菜（Gelidium amansii）：青岛海悠悠商贸有限公司；小球藻（Chlorella vulga）：上海光语生物科技有限公司；乙酸乙酯（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；1-二苯基-2-苦基肼自由基：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；石油醚（60～90 ℃）、甲醇（色谱级）、乙醇、香兰素（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸：衡阳市凯信化工试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-100紫外可见光光度计：上海美普达仪器有限公司；WFH-203B三用紫外分析仪：上海精科实业有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；Primaide高效液相色谱仪：天美（中国）科学仪器有限公司福州分公司；ultimate分析型反向C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：月旭科技（上海）股份有限公司；7890-B/5977A气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方式
（1）将海藻（江蓠，刺麒麟菜，异枝麒麟菜，石花菜，小球藻）分别用清水洗净。在阳光下进行自然风干后，使用研磨机粉碎并100目筛子过筛，收集海藻粉末。
（2）取1.5 kg海藻粉末放入提取缸中，倒入体积分数95%乙醇溶液至完全浸没，置于55 ℃的温水浴中提取24 h，用真空旋转蒸发器将提取液蒸干，所得的回收液继续用于提取。反复提取直至提取液颜色变淡呈澄清透明状（约4次）。蒸干所得的浸出物用于下一步分离萃取。
（3）将上一步得到的浸出物用体积分数为90%甲醇-水溶解，用等体积石油醚萃取3次，合并3次萃取液；蒸干得到石油醚相。将之前萃取后90%甲醇-水配制成10%甲醇-水，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，蒸干得到乙酸乙酯相。萃取后的10%甲醇-水蒸干。
（4）将上一步所得分离物分别用石油醚（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、水进行溶解，并于冰箱中保存待用。
1.3.2 薄层层析色谱
（1）点样：用溶剂将试样溶解，终质量浓度为100 mg/mL，然后用毛细管（内径0.5 mm）吸取少许试样溶液在荧光薄层硅胶板上进行点样（为大小均匀的小圆点，且应大小适宜）。一个平板上分别点上水、石油醚、乙酸乙酯层的分离物，以便对比，每个点的距离相等，且不宜太过靠近边沿。
（2）展开：用电吹风（冷风，以免破坏样品）将样点吹干，然后将荧光薄层硅胶板竖直放入装有展开剂的有盖的展开玻璃槽中。展开剂不能接触到样品点，但必须接触到吸附剂的下沿。将展开槽盖上盖子，展开。等待展开剂上行到TLC板的上端（事先确定好的溶剂前沿线），最后取出薄层板，自然晾干。
（3）显色：首先在波长254 nm的紫外光下操作，标出其荧光区域，最后用硫酸香草醛显色剂浸泡后于用电吹风（热风，大风力）加热并吹干，使其显色。
1.3.3 高效液相色谱分析
将不同洗脱梯度下的粗提取物蒸干，然后取1 mL 100 mg/mL的提取物，将其溶于甲醇中，使用微滤膜进行过滤，进行高效液相色谱分析。分析条件：n=210 nm，254 nm；温度25 ℃；载体流速2 mL/min；进样量20 μL。
洗脱条件为0 min：90%超纯水，10%甲醇；0～45 min：90%超纯水～0%超纯水，10%～100%甲醇；45～60 min：100%甲醇；检测器：UV检测器。
1.3.4 气相色谱-质谱联用
（1）化学成分的分离与鉴定：取少量石油醚，加入到石油醚提取物中溶解，溶解后用过滤针筒进行过滤，每次抽取1 mL，然后置于进样瓶中进样，用气相色谱-质谱联用仪进行分析，通过NIST 08谱库对各组分的质谱数据进行检索分析，确定各组分物质，用气相色谱峰面积归一化法进行计算，得出含量。
（2）气相色谱条件：色谱柱DB-wax极性柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），进样口温度240 ℃，柱箱温度260 ℃，采用程序升温：60 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持4 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持30 min，柱流量2.0 mL/min，进样量1.0 mL，分流比10∶1。
2 结果与分析
2.1 海藻乙酸乙酯相的薄层层析色谱分析
将得到的海藻利用试剂比例为石油醚∶乙酸乙酯=10∶1的展开剂进行TLC分析，结果见图1。
图1 五种海藻乙酸乙酯相薄层层析分析色谱图
Fig.1 Thinner layer chromatogram of ethyl acetate phase of five species of algae
1、江蓠，2、刺麒麟菜，3、异枝麒麟菜，4、石花菜，5、小球藻；展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=10∶1。
由图1可知，通过观察五种海藻石油醚∶乙酸乙酯=10∶1洗脱的薄层层析色谱分析结果，可以发现江蓠有两条显色明显的条带，石花菜有三条显色明显的条带，说明江蓠和石花菜次级代谢产物较丰富，并且易于提取分离。
2.2 海藻乙酸乙酯相的高效液相色谱分析
五种海藻的乙酸乙酯相组分的HPLC图谱见图2。由图2可知，其中，江蓠、石花菜和小球藻在210 nm波长下具有明显的紫外吸收峰，在254 nm波长处没有明显的紫外吸收峰，而刺麒麟菜和异枝麒麟菜在210 nm和254 nm波长下都有明显的紫外吸收峰；江蓠和石花菜在保留时间5～10 min处出现两个大峰，刺麒麟菜和异枝麒麟菜在保留时间5～15min处出现四个大峰，保留时间较近，推断为大极性具有紫外吸收的代谢产物；江蓠和石花菜在保留时间20～35 min处出现三个大峰，刺麒麟菜和异枝麒麟菜在保留时间20～40 min出现5个大峰，小球藻在保留时间30 min左右出现一个大峰，保留时间45～55 min出现一些临近的大峰，它们的保留时间相差较大，推断为中极性和小极性具有紫外吸收的代谢产物。
图2 五种海藻的乙酸乙酯相高效液相色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of ethyl acetate phase of five species of algae
综合观察发现，江蓠、刺麒麟菜、异枝麒麟菜、石花菜均在5～15 min出现大峰并且保留时间相似，可能为同一化合物，故研究其中一种海藻就有可能得到这4种海藻共同的化合物，同时江蓠、刺麒麟菜、异枝麒麟菜的其他出现大峰的保留时间也较相似，可能为海藻中较常见代谢产物，不具有研究价值。而石花菜与江蓠、刺麒麟菜、异枝麒麟菜相比，有三个峰是保留时间相差较大，峰面积较大，易于提取并且具有与其他海藻不同的化合物，具有一定的研究价值。将小球藻与以上4种海藻对比发现，其峰较集中在极性较低的区域，不易提取纯化。
2.3 海藻石油醚相气相色谱分析
五种海藻石油醚相气相色谱图见图3。由图3可知，江蓠有6个峰；刺麒麟菜有6个峰；异枝麒麟菜有5个峰；石花菜有5个峰；小球藻有8个峰。
图3 五种海藻石油醚相气相色谱图
Fig.3 Gas chromatogram of petroleum ether phase of five species of algae
A～E分别代表江蓠、刺麒麟菜、异枝麒麟菜、石花菜、小球藻。
江蓠的石油醚相成分分析结果（表1）可知，江篱石油醚相的成分组成共检测出31种物质，成分较为复杂，主要分为以下几类：酸（80.71%）、醇（1.32%）、酯（2.06%）、醛（2.02%）、烷烃（3.27%）、酮类（1.59%），其中成分最多为棕榈酸，相对百分比为76.73%。
刺麒麟菜的石油醚相成分分析结果（表2）可知，刺麒麟菜石油醚相的成分组成共检测出29种物质，成分较为复杂，主要分为以下几类：酸（80.4%）、酯（0.49%）、烷烃（2.74%）、酮类（1.32%），其中成分最多的为十六酸，相对百分比为65.94%。
表1 江蓠石油醚相成分分析
Table 1 Composition analysis of petroleum ether phase of Gracilaria tenuistipitata
表2 刺麒麟菜石油醚相成分分析
Table 2 Composition analysis of petroleum ether phase of Eucheuma spinosum
续表
异枝麒麟菜石油醚相成分分析结果（表3）可知，异枝麒麟菜的石油醚的成份组成共检测出19种物质，主要分为以下几类：酸（83.05%）、烷烃（3.03%）、酮类（1.27%），其中成分最多的为十六酸，相对百分比为78.94%。
表3 异枝麒麟菜石油醚相成分分析
Table 3 Composition analysis of petroleum ether phase of Eucheuma striatum
石花菜的石油醚相成分分析结果（表4）可知，石花菜石油醚的成分组成共检测出33种物质，成分较为复杂，主要分为以下几类：酸（73.08%）、醇（0.61%）、酯（5.68%）、烷烃（8.99%），其中成分最多为十六酸，相对百分比为65.42%。
表4 石花菜石油醚相成分分析
Table 4 Composition analysis of petroleum ether phase of Gelidium amansii
小球藻石油醚相成分分析结果（表5）可知，小球藻石油醚相成分组成共检测出36种物质，成分较为复杂，主要分为以下几类：酸（10.11%）、醇（5.71%）、酯（70.25%）、烷烃（0.93%）、醛类（0.03%）、酮类（1.11%），其中成分最多为亚油酸乙酯，相对百分比为29.41%。
表5 小球藻石油醚相成分分析
Table 5 Composition analysis of petroleum ether phase of Chlorella vulga
分析结果对比发现，石花菜、小球藻具有除酸类化合物外的其他复杂有机化合物，并且种类多，成分复杂，未知种类具有一定数量。特别是小球藻较于其他海藻来说，酯类含量丰富，易于提取不饱和脂肪酸。
3 结论
本实验主要通过化学筛选方法（TLC，HPLC，GC-MS）对五种海洋海藻进行了初步化学筛选。通过TLC分析得出江蓠和石花菜显色明显，代谢产物丰富；再通过HPLC分析得出石花菜的乙酸乙酯相代谢产物极性相差较大，多为中、小极性化合物，易于提取分离具有一定价值的化合物；结合GC-MS分析得出，石花菜、小球藻的石油醚相具有除酸类化合物外的其他复杂有机化合物，种类多，成分复杂，未知化合物具有一定数量，可深入进行研究，但小球藻的HPLC结果显示它提取纯化难度极大。因此，综合TLC、HPLC和GC-MS的结果得出，石花菜最适合进行下一步的研究。此化学筛选仅能初步判断代谢产物的丰富度以及分离纯化方法，进一步研究还需结合生物活性筛选，将会大大提高海藻产品研发实验效率。
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