蛋白饲料是水产、禽畜养殖的重要资源，目前，世界各国对饲料蛋白的需求量都很大，而鱼粉等传统蛋白饲料价格正在提高，寻找潜在的、优质的蛋白饲料是目前养殖业的重要目标之一。因此，优化饲料配方、降低饲料成本是养殖业重要的研究问题[1-2]。
辣木是一种尚未充分开发的多功能新型材料，具有产量高、适应性广、栽培简便、抗逆性强等特点。辣木籽在生产辣木油后，剩余的辣木籽粕如果未被充分利用就被丢弃，会造成环境污染和巨大的浪费。辣木籽粕本身有较高的粗蛋白含量（25%～36%），但植物原料常常含有抗营养因子，直接作为饲料难以被消化，甚至可能导致幼崽死亡。许多微生物具有丰富的酶系，可以降解、转化糟粕类废渣，废渣经过益生菌发酵处理后，能够显著增加其中的有益活性代谢产物[3-8]，如维生素、氨基酸、小肽等营养物质的含量，降解抗营养因子[9-10]，提高发酵饲料的营养价值和口感风味[11-13]，延长饲料的贮存期，通过饲喂发酵饲料，可改善动物肠道微生物生态，维持肠道pH稳定，同时降低生产成本，是理想的开发辣木籽粕的方法。辣木籽作为饲料可提高肉鸡的肉脂、能量、多不饱和脂肪酸[14-15]，直接利用辣木叶[16-17]、辣木籽作为饲料或者将辣木叶用于制作青贮饲料的报道较多，但开发利用辣木籽粕固态发酵生产蛋白饲料的报道较少。
利用屎肠球菌、黑曲霉和米根霉对辣木籽粕进行固态发酵，通过单因素试验和正交试验设计对其接种顺序、发酵培养基含水量、接种量和发酵时间进行发酵条件的优化，确定了开发利用辣木籽粕生产发酵蛋白饲料的最佳工艺，以期为开发利用辣木籽粕提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
辣木籽粕（使用前经过粉碎，粗蛋白含量35.38%，酸溶蛋白含量5.10%）：由天源利生物科技（广州）有限公司提供。
屎肠球菌（Enterococcus faecium）A1（美国国家生物信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）登录号MN474019），米根霉（Rhizopus oryzae）E20360（NCBI登录号MK267423），黑曲霉（Aspergillus niger）B1（NCBI登录号MN474007）：均为前期试验分离得到。
MRS培养基（制作平板时添加2%琼脂），马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基（制作平板时添加2%琼脂）：广东环凯微生物科技有限公司；固态发酵培养基（辣木籽粕，根据试验条件，加入蒸馏水调整含水量，121 ℃灭菌20 min）。
五水硫酸铜、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：广州化学试剂厂；硫酸钾、硼酸（均为分析纯）：致远化工天津有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Autoclave SP510高温灭菌锅：日本Yamato科技有限公司；SW-CK-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LRH-150B培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；KDN-1自动凯氏定氮仪：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种活化
在无菌操作下，挑取米根霉、黑曲霉一环，分别接种到PDA培养基上；挑取屎肠球菌一环接种到MRS培养基上。30 ℃培养48 h。
1.3.2 菌种扩大培养
米根霉、黑曲霉扩大培养：配制PDA液体培养基，分装于250mL带挡板的三角瓶（每瓶50 mL培养基），灭菌后分别接种活化后的米根霉、黑曲霉，30 ℃分别培养12 h、24 h；屎肠球菌扩大培养：配制MRS培养基，分装于250 mL三角瓶（每瓶50 mL培养基），灭菌后接种活化后的屎肠球菌，37 ℃培养14 h。根据前期试验结果，米根霉、黑曲霉和屎肠球菌分别培养12 h、24 h和14 h后，菌种到达对数生长期，有利于适应固态发酵培养基环境。
1.3.3 培养条件对辣木籽粕发酵转化的影响
基本发酵条件：称取一定量辣木籽粕于250 mL锥形瓶中，加入蒸馏水调整含水量，使发酵培养基总质量为40 g。121 ℃灭菌20 min，冷却至室温，在无菌条件下接种种子液（各种子液接种比例为1∶1∶1），30 ℃培养。发酵结束后，45 ℃烘干，磨粉，测定粗蛋白和酸溶蛋白含量、酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性。
在上述发酵条件下进行单因素试验，研究接种顺序（①先接种屎肠球菌，发酵一半时间后接种米根霉和黑曲霉；②先接种米根霉和黑曲霉，发酵一半时间后接种屎肠球菌；③同时接种屎肠球菌、米根霉和黑曲霉）、培养基含水量（20%、30%、40%、50%、60%）、接种量（10%、15%、20%、25%、30%）和发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）对辣木籽粕发酵后粗蛋白和酸溶蛋白含量、酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性的影响。各组试验重复3次。
1.3.4 工艺条件优化正交试验
根据单因素试验的结果，接种顺序、含水量、接种量和发酵时间以表1水平进行L9（34）的正交试验。
表1 辣木籽粕发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Moringa oleifera seed meal
1.3.5 测定方法
粗蛋白的测定：改良的凯氏定氮法[18]，在消解步骤中加入过氧化氢加快消解过程。
酸溶蛋白的测定[19]：称取1.00 g样品加入烧杯，加入50 mL 15%三氯乙酸，超声振荡提取15 min。提取液过滤后，取10 mL提取液用上述改良的凯氏定氮法测定样品酸溶蛋白含量。
蛋白酶活性测定[20]：测定酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性使用了福林酚法。在一定温度（40±0.2）℃和相应的pH条件下（酸性蛋白酶为pH 3.0，中性蛋白酶为pH 7.2），定义在1 min内水解酪蛋白产生相当于1 μg酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量为1个酶活单位，以U表示。
1.3.6 统计学分析方法
各指标采用了SPSS 22.0软件对数据进行了极差分析和方差分析。
2 结果与分析
2.1 接种顺序对辣木籽粕生物转化的影响
由图1可知，接种顺序对酸溶蛋白、酸性蛋白酶和中性蛋白酶有显著影响（P＜0.05），对粗蛋白含量影响不显著（P＞0.05）。先接种霉菌时，各指标均达到最高值，粗蛋白和酸溶蛋白分别达到44.39%和8.25%，酸性蛋白酶与中性蛋白酶活性分别为103.12 U/g和528.44 U/g。米根霉、黑曲霉具有丰富的酶系，可将原料的大分子化合物降解为易消化的小分子化合物，也可以利用分解得到的小分子化合物合成新的生物大分子，有利于提高材料的营养价值，也为后续接种屎肠球菌提供了营养丰富的环境。接种顺序对粗蛋白外的3个指标均有显著影响，因此选择先接种黑曲霉和米根霉，发酵一半时间后，再接种屎肠球菌进行后续试验。
图1 接种顺序对辣木籽粕生物转化的影响
Fig.1 Effect of inoculation order on biotransformation of Moringa oleifera seed meal
2.2 培养基含水量对辣木籽粕生物转化的影响
图2 含水量对辣木籽粕生物转化的影响
Fig.2 Effect of water content on biotransformation of Moringa oleifera seed meal
由图2可知，培养基含水量对4个指标均有显著影响（P＜0.05）。当含水量为40%时，粗蛋白含量达到最高值44.55%；当含水量为50%时，酸溶蛋白含量达到最高值9.22%；当含水量为30%时，酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性达到最高值，分别为161.47 U/g和711.82 U/g。在固态发酵中，传质依赖于培养基的自由水，当含水量较低时，自由水不足，传质效率较低，会阻碍微生物的生长，当含水量较高，发酵培养基的孔隙率降低，溶氧下降，会抑制霉菌的生长。因此选择含水量30%、40%、50%进行后续试验。
2.3 接种量对辣木籽粕生物转化的影响
图3 接种量对辣木籽粕生物转化的影响
Fig.3 Effect of inoculum on biotransformation of Moringa oleifera seed meal
由图3可知，接种量对4个指标均有显著影响（P＜0.05）。在接种量为20%时，粗蛋白和酸溶蛋白含量均达到最高值，分别为42.11%和11.80%；当接种量为15%时，酸性蛋白酶和中性蛋白酶均达到最高值，分别为107.34 U/g和565.14 U/g。当接种量较低，微生物酶解发酵底物的起始效率较低，需要更多的时间生长繁殖才能对底物有较高的利用效率。随着接种量的提高，培养基微生物量达到峰值的时间逐步缩短，不仅可以提高效率，而且由于接种微生物具有较大的生长优势，可以减少污染杂菌的机会。当接种量过大，微生物生长过快会导致发酵底物营养物质消耗过快，代谢产物堆积，酶活性下降，过早进入衰亡期，微生物大量死亡，代谢效率下降。因此选择接种量15%、20%、25%进行后续试验。
2.4 发酵时间对辣木籽粕生物转化的影响
图4 发酵时间对辣木籽粕生物转化的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on biotransformation of Moringa oleifera seed meal
由图4可知，发酵时间对4个指标均有显著影响（P＜0.05）。在发酵时间为2 d时，粗蛋白和酸溶蛋白达到最高值，分别为43.07%和9.44%；当发酵时间为3 d时，酸性蛋白酶和中性蛋白酶达到最高值，分别为158.72 U/g和524.77 U/g。随着发酵时间的延长，微生物合成代谢产物逐步积累，但后期又再下降，推测是在发酵后期，微生物以分解代谢为主导，随着微生物数量的增多，代谢产物不断积累，微生物代谢受到抑制，酶活开始下降。因此选择发酵时间1 d、2 d、3 d进行后续试验。
2.5 工艺条件优化正交优化
在单因素试验的基础上，选择接种顺序（A）、发酵培养基含水量（B）、接种量（C）和发酵时间（D）等4个因素进行L9（34）正交试验考察发酵条件对辣木籽粕发酵前后两种蛋白含量和两种蛋白酶活性的影响，正交试验结果与分析见表2，极差分析见表3，方差分析见表4。
表2 辣木籽粕发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Moringa oleifera seed meal
表3 正交试验结果极差分析
Table 3 Range analysis of orthogonal experiments results
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示在0.05水平上对结果影响显著。
由表3可知，对于因素A和因素C，直接取A2、C2水平。根据综合平衡法，因素B、因素D分别选取B3、D3水平。因此，固态发酵培养基的优组合为A2B3C2D3，即先接种米根霉和黑曲霉，发酵36 h后接种屎肠球菌，培养基含水量50%，接种量20%（接种比例1∶1∶1），30 ℃条件下发酵3 d。该组合进行验证试验（重复3次），与未发酵的辣木籽粕相比，得到的发酵辣木籽粕粗蛋白含量为46.78%，提高了32.22%；酸溶蛋白含量为11.30%，提高了121.57%；酸性蛋白酶活性为77.06 U/g，中性蛋白酶活性为711.93 U/g。除酸性蛋白酶活性较低外，粗蛋白含量、中性蛋白酶活性与正交试验对应指标最高值（分别为43.86%和849.74 U/g）无显著差异（P＞0.05），酸溶蛋白含量显著高于第4组（为6.65%）（P＜0.05），除酸性蛋白酶活性较低外，其余指标均达到该指标的最高水平，该组合为较优组合。
由方差分析（见表4）可知，在正交试验条件范围内，4个因素对粗蛋白没有显著影响（P＞0.05）；接种顺序与发酵时间对酸溶蛋白有显著影响（P＜0.05），发酵培养基含水量和接种量对酸溶蛋白无显著影响（P＞0.05）；接种顺序、接种量和发酵时间对酸性蛋白酶有显著性影响（P＜0.05），含水量对酸性蛋白酶无显著影响（P＞0.05）；接种顺序、含水量和发酵时间对中性蛋白酶具有显著性影响（P＜0.05），接种量对中性蛋白酶无显著性影响（P＞0.05），与极差分析结果相符。
3 结论
屎肠球菌、米根霉和黑曲霉混菌发酵辣木籽粕可提高其粗蛋白及酸溶蛋白含量，菌种接种顺序对发酵效果有显著影响，最佳条件为先接种黑曲霉和米根霉，发酵36 h后，再接种屎肠球菌，在培养基含水量50%，总接种量20%的条件下30 ℃发酵3 d。与未发酵的辣木籽粕相比，发酵后辣木籽粕粗蛋白达46.78%，提高了32.22%，酸溶蛋白达11.30%，提高了121.57%，同时酸性蛋白酶活性达77.06 U/g，中性蛋白酶活性达711.93 U/g。可见，发酵辣木籽粕综合营养价值得到提高，具有更好的消化性能。该结果为辣木籽粕深加工开发提供了依据。
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