磷是除氮外限制植物生长的第二营养元素，在光合作用等过程中起着至关重要的作用[1-2]。由于土壤中有效磷的缺乏，速效磷肥被大量使用，而绝大部分的磷肥进入土壤后与Ca2+等金属离子结合形成Ca3（PO4）2等难溶性磷，难以被植物吸收利用[3-4]。既造成有限磷矿资源大量浪费，还加剧农业资源污染问题[5]。好氧堆肥法能在一定程度上缓解肥料紧缺和环境污染方面的压力，而解磷微生物菌剂的加入，不但可以加快肥料的腐熟，还可以促进磷素的转化，提高肥效[6]。
目前，大量的解磷微生物相关的研究成果已被先后报道，解磷细菌主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和洋葱伯克霍尔德菌属（Burkholderia）等[7-11]；解磷真菌主要为青霉属（Penicillium）、根霉属（Rhizopus）、曲霉属（Aspergillus）等[12-15]。实际上，解磷微生物的溶磷过程极其复杂，并非其中单一的某一因素起所有作用，而是多种因素共同作用的结果[16]。有关解磷微生物溶磷培养条件的优化早有研究[10，15]，获得了大量研究成果。除简单的单因素优化的研究外，也有采用正交法或者响应面法等进行进一步优化实验的相关研究，从而尽多的探究更多因素对解磷微生物解磷条件的影响[17-18]。但上述所涉及的研究内容基本为非高温解磷微生物，并不适用于好氧堆肥下的高温条件。目前国内外对于耐高温解磷微生物的研究相对较少，其中对耐高温解磷真菌的研究更为稀缺。
本实验早期筛选获得的溶磷效果较好的耐高温解磷真菌菌株GDF1，通过单因素试验及响应面试验，调整碳源、氮源等培养条件，探究解磷菌株解磷效果最佳时的溶磷条件，以期为GDF1菌株投入高效微生物菌肥的生产提供一定的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种来源
耐高温解磷真菌GDF1为本实验室从白酒丢糟高温堆肥样品中筛选获得。
1.1.2 培养基
无机磷发酵液体培养基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g；蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。其中Ca3（PO4）2需与其他药品分开灭菌后再混合。
马铃薯葡萄糖固体培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂14 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.8～6.2，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
JJ-CJ-IFD型超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；THZ-82数显恒温气浴振荡器：天津赛得里斯实验分析仪器制造厂；101-1AB电热恒温干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；SpectraMax190
酶标仪：美谷分子仪器有限公司；YXQ-LS-75G立式压力蒸汽灭菌锅、BMJ-250C培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA-2004N电子分析天平：上海菁海仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 解磷能力测定
将充分活化后的出发菌株GDF1接种于PDA培养基上，置于37 ℃培养数天至菌落布满整个平板，加无菌水洗脱并用脱脂棉过滤，制备孢子悬浮液，经镜检孢子量约为1×107 CFU/mL。
将孢子悬浮液以1%接种量接入无机磷液体培养基中，并以1%无菌水代替1%孢子悬浮液作空白对照，重复3次，作为平行。置于50 ℃、180 r/min恒温振荡器中培养5 d后取出，10 000 r/min条件下离心5 min，上清液经0.45 μm 滤膜过滤后采用钼锑抗比色法[16]测定发酵上清液中的磷含量。以波长700 nm处测定吸光度值（OD700nm值）（y）为纵坐标，溶磷量（x）为横坐标绘制磷标准曲线，得到钼锑抗磷标准曲线线性回归方程为y=0.300 5x+3×10-6，相关系数R2=0.999 8，通过磷标准曲线回归方程计算溶液中有效磷含量，以确定菌株的解磷能力。
1.3.2 解磷条件优化
（1）碳氮源种类的优化
碳源种类的优化：分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖及甘露醇为唯一碳源（10.0 g/L），其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，探究不同碳源种类对其解磷能力的影响。
氮源种类的优化：分别以硫酸铵、草酸铵、硝酸铵、硝酸钠、乙酸铵及氯化铵为唯一氮源（0.5 g/L），其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，探究不同氮源种类对其解磷能力的影响。
（2）碳氮源、无机盐及磷源浓度的优化
碳源浓度的优化：以最优种类碳源为唯一碳源，质量浓度分别为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，探究不同碳源浓度对其解磷能力的影响。
氮源浓度的优化：以最优种类氮源为唯一氮源，质量浓度分别为0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，研究不同氮源浓度对其解磷能力的影响。
无机盐浓度的优化：以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O为无机盐组合，总质量浓度分别为0.48 g/L、0.96 g/L、1.44 g/L、1.92 g/L、2.40 g/L，其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，探究不同无机盐浓度对其解磷能力的影响。
磷源浓度的优化：以磷酸三钙（Ca3（PO4）2）为唯一磷源，质量浓度分别为2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L，其他培养基成分不变，进行解磷能力的测定，探究不同磷源浓度对其解磷能力的影响。
（3）响应面法优化
根据单因素试验结果，选取碳源质量浓度（A）、草酸铵质量浓度（B）、无机盐浓度（C）及磷酸三钙质量浓度（D）为自变量，以GDF1的溶磷量为响应值，对其解磷条件进行优化，利用各因素两两交互响应面、等高线以及响应面回归模型进行优化，找出GDF1出现最大溶磷量所对应各因素的最优值，并进行验证试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 溶磷条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for phosphorus-solubilizing conditions optimization
2 结果与分析
2.1 碳氮源种类的优化
分别以10 g/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖及甘露醇作为碳源进行液体发酵培养基最适碳源种类的筛选。试验结果表明，不同碳源对菌株GDF1溶解磷酸三钙的能力有差异，溶液中有效磷含量大小依次为蔗糖＞葡萄糖＞麦芽糖＞甘露醇＞果糖＞乳糖，GDF1利用蔗糖作为碳源表现出更好的解磷能力，溶磷量为221.76 mg/L。
图1 碳源（a）和氮源（b）种类对菌株GDF1溶磷能力的影响
Fig.1 Effect of carbon source (a) and nitrogen source (b) type on the phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1
分别以0.5 g/L硫酸铵、草酸铵、硝酸铵、硝酸钠、乙酸铵及氯化铵作为氮源进行液体发酵培养基最适氮源种类的筛选。试验结果表明，不同氮源对菌株GDF1溶解磷酸三钙的能力有差异，溶液中有效磷含量大小依次为草酸铵＞硫酸铵＞氯化铵＞硝酸钠＞乙酸铵＞硝酸铵，GDF1利用草酸铵作为碳源表现出更好的解磷能力，溶磷量为227.46 mg/L。
由以上试验结果可得，GDF1的解磷培养基中最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为草酸铵。
2.2 碳氮源、无机盐及磷源浓度的优化
以蔗糖为唯一碳源，培养基其他成分不变，进行解磷能力的测定。结果表明，随着蔗糖质量浓度增加，溶磷量呈现先增加后降低的趋势，当其质量浓度达到10 g/L时，溶磷量最高，为228.33 mg/L。该结果趋势与前人研究结果类似[19-20]，即不同的解磷微生物各自存在一个最适碳源浓度，在低于该值的范围内解磷微生物的解磷能力会随着碳源浓度的增加而增大，而一旦超过这个值，解磷微生物的解磷能力就会开始逐渐下降。
图2 蔗糖（a）、草酸铵（b）、无机盐（c）及磷酸三钙（d）质量浓度对菌株GDF1溶磷能力的影响
Fig.2 Effect of sucrose (a),ammonium oxalate (b),inorganic salt (c)and tricalcium phosphate (d) concentration on phosphorussolubilizing ability of strain GDF1
以草酸铵为唯一氮源，培养基其他成分不变，进行解磷能力的测定。结果表明，随着草酸铵浓度增加，溶磷量呈现先增加后降低的趋势，当其质量浓度达到0.5 g/L时，溶磷量最高，为227.83 mg/L。氮源作为培养基组成的重要成分，在合适的浓度下，能促进解磷微生物的繁殖生长，从而加快磷转化的进程，发酵液中的溶磷量随之上升，但浓度过高时可能培养到后期会影响培养基的pH值，从而对微生物生长产生不利影响，而导致发酵液中的溶磷量下降。
以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O为无机盐组合，培养基其他成分不变，进行解磷能力的测定。结果表明，随着无机盐质量浓度增加，溶磷量呈现先增加后降低的趋势，当其质量浓度达到0.96 g/L时，溶磷量最高，为228.32 mg/L。这种趋势的出现推测可能与解磷微生物溶磷机制中的金属离子的螯合作用机制有关。
以磷酸三钙为唯一磷源，培养基其他成分不变，进行解磷能力的测定。结果表明，随着磷酸三钙质量浓度增加，溶磷量呈现先增加后降低的趋势，当其质量浓度达到10.0g/L时，溶磷量最高，为237.81 mg/L。该趋势可能是由于当难溶性磷浓度低的时候，菌株GDF1可以利用转化的磷原料少，所以发酵液中的溶磷量较少；随着磷酸三钙的增加GDF1可转化的难溶性磷原料增加，发酵液中的溶磷量也随之增加并达到最大值；而当磷酸三钙浓度过高的时候，可能会对GDF1的生长繁殖有抑制作用，从而导致发酵液中的溶磷量下降。
2.3 响应面法优化结果与分析
2.3.1 响应面试验结果
运用根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，通过蔗糖质量浓度（A）、草酸铵质量浓度（B）、无机盐质量浓度（C）和磷酸三钙质量浓度（D）进行4因素3水平的响应面分析试验。以溶磷量（R）为响应值，响应面试验设计与结果见表2。
表2 溶磷条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for phosphorus-solubilizing conditions optimization
续表
2.3.2 响应面试验结果及方差分析
利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，以R为溶磷量，A、B、C和D分别对应蔗糖、草酸铵、无机盐和磷酸三钙的编码。得到二次多项回归方程：
对于上述回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，结果见表3。
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface methodology results
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
由表3方差分析结果可知，模型的F=95.03，P＜0.000 1差异极显著，并且失拟项P=0.672 5＞0.05，故说明该模型是显著的。模型的决定系数R2=0.989 6，说明拟合程度很好，且调整决定系数R2adj=0.979 2，预测决定系数R2pre=0.955 1，方差相差很小，说明可信度高，可以用此模型来分析和预测溶磷量最优提取工艺。蔗糖、草酸铵和磷酸三钙对溶磷量影响均显著（P＜0.05），无机盐对溶磷量影响不显著（P＞0.05）；因素对溶磷量影响程度为D＞B＞A＞C。对于交互作用来说，蔗糖和草酸铵、蔗糖和磷酸三钙、草酸铵和磷酸三钙以及无机盐和磷酸三钙交互作用对溶磷量的影响显著（P＜0.05），蔗糖和无机盐以及草酸铵和无机盐交互作用对溶磷量的影响不显著（P＞0.05），对于模型的二次项来说均极显著。
2.3.3 响应面结果及分析
响应面优化模型各因素（蔗糖、草酸铵、无机盐和磷酸三钙）两两交互作用对溶磷量影响的响应面和等高线见图3。
图3 各因素交互作用对菌株GDF1溶磷能力影响的响应曲面和等高线
Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1
由图3分析可知，蔗糖和草酸铵交互作用对溶磷量影响的等高线图为椭圆形，说明蔗糖和草酸铵交互作用对溶磷量影响的显著。当草酸铵不变时，随着蔗糖的增加，溶磷量呈现先上升后下降的趋势；同样，当蔗糖不变时，随着草酸铵增加，溶磷量也呈现先增加后减小的趋势。蔗糖和无机盐以及草酸铵和无机盐交互作用对溶磷量的影响的等高线图都接近圆形，说明对结果的影响不显著（P＞0.05）。蔗糖和磷酸三钙间交互作用对溶磷量的影响的等高线图为椭圆形，且由图3可以看出，结果随着因素的改变的变化明显，说明此因素交互作用对结果的影响显著。草酸铵和磷酸三钙以及无机盐和磷酸三钙交互作用对溶磷量的影响的等高线图为较扁的椭圆形，说明对溶磷量的影响较为显著，随着因素的增加，溶磷量先增加，达到最大值后出现下降。
响应面图均为开口向下的凸面，故响应值R存在极大值，为进一步优化结果，根据Design-Expert 8.0.6软件得出在蔗糖、草酸铵、无机盐和磷酸三钙交互影响下，最优提取工艺为：蔗糖为10.65 g/L，草酸铵为0.61 g/L，无机盐为1.02 g/L，磷酸三钙为10.70 g/L。在此条件下模型预测的溶磷量为291.35 mg/L。
2.3.4 验证试验
为了方便实际操作，修改溶磷条件为蔗糖10.7 g/L，草酸铵0.6 g/L，无机盐1.0 g/L，磷酸三钙10.7 g/L。在此条件下进行验证测试，经过3轮重复验证，验证组中测得的溶解磷量实际值为292.59 mg/L，与预测值291.35 mg/L接近，该结果说明此模型具有较好的可信度，可用于后续研究。
3 结论
研究结果表明不同种类的碳源和氮源会影响菌株GDF1的溶磷效果，通过单因素试验设计及响应面试验先后对菌株GDF1 的溶磷条件进行了优化。结果显示，耐高温菌株GDF1的最佳解磷条件为：蔗糖10.7 g/L，草酸铵0.6 g/L，无机盐1.0 g/L，磷酸三钙10.7 g/L。在此优化条件下，实际验证溶磷量为292.59 mg/L。本试验中的菌株GDF1是耐高温解磷真菌，经优化后，在耐高温解磷微生物中解磷性能表现良好，可作为耐高温微生物制剂的潜在原料，为推动耐高温解磷微生物的应用提供理论基础和技术支撑。
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