黑木耳（Auricularia auricular）是一种营养丰富的食用菌，已有众多研究表明其富含粗蛋白、粗多糖、腺苷类物质、膳食纤维、黄酮、维生素K、纤维素和多种人体必备矿物质元素等[1-2]。同时黑木耳有多种生物学活性以及很高的药理价值，有清除自由基、群体感应等功能，对预防和减缓高血压、高血脂也有积极作用[3-4]。白刺果（Nitraria tangutorum）是在中国干旱地区广泛种植的一种灌木植物，有“沙漠樱桃”之称。果实中蛋白质含量丰富，氨基酸种类齐全[5]。维生素、有机酸和钙、铁、锌等微量元素也十分充足，含有安全无毒的天然红色素，有较高的应用价值[6]。
近年来，发酵饮料行业受到越来越多关注，由于拥有特定的营养功效和口感，发酵技术已被应用到很多软饮料中[7]。其中，乳酸菌应用极其广泛。乳酸菌的发酵可以减缓果（Lactobacillus plantarum）蔬中酚类物质的分解，提高抗氧化的能力[8-9]。植物乳杆菌作为最常见的乳酸菌之一，常用于发酵食品中，具有多种益生作用，如改善胃肠道功能、调节肠道菌群平衡、增强生物屏障、降胆固醇及吸附重金属等[10]。与乳制品为原料相比，以食用菌和水果为原料进行发酵是乳酸菌发酵未来的发展趋势[11]。
本实验选取黑木耳和白刺果为原料，经过植物乳杆菌发酵，制备黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料，并采用单因素及响应面试验优化乳酸发酵工艺，确定发酵工艺参数。不仅让我国丰富的木耳资源得到充分利用，还添加白刺果来改善产品颜色，调节产品风味，使复合乳酸饮料克服了单一木耳发酵在感官品质上的不足。且乳酸发酵赋予了饮料独特的口感，既可以满足消费者口味的差异化，也满足生物技术的发展趋势，为乳酸菌饮料的开发提供了新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑木耳：市售；白刺果：都兰海枝红生物科技有限责任公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：实验室保藏；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（化学纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、苯酚（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硼酸（分析纯）：天津市博迪化工有限公司。
1.2 仪器与设备
722S 可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ZHWY-211B 恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理机：九阳股份有限公司；SHP-150 生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；SX-500压力蒸汽灭菌锅：日本TOMY公司；JJ-2 组织捣碎匀浆机：江苏杰瑞尔电器有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；WYA-2W双目数字阿贝折射仪：上海精科仪电物光仪器有限公司；QN-30压盖机：湖南省科特包装检测技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料加工工艺流程
1.3.2 操作要点
挑选、水洗、浸泡：选择干净无杂质、无霉变的优质黑木耳，粒大、饱满、无杂质的白刺果，取适量的水洗涤干净，木耳放入足量的水中浸泡50～60 min，待其完全泡发膨胀，备用。
打浆、过滤：黑木耳和白刺果质量比为5∶1，按所需用量称取泡发后的黑木耳和白刺果。此时原料打浆后还原糖含量为8.21 mg/mL，可以为植物乳杆菌发酵提供充分的碳源[12]。原料与水按1∶8（g∶mL）的固液比加水，打浆。打浆后的混合原浆，用四层纱布过滤获得滤液。
杀菌：混合浆液在65 ℃下杀菌30 min。
乳酸菌发酵：混合浆液的植物乳杆菌接种量为2%（V/V），在37 ℃的恒温摇床中进行发酵，待63 h后发酵结束。
均质、离心：发酵原液在8 000 r/min条件下均质5 min。再放入离心机10 000 r/min条件下离心15 min。
风味调配、灌装：澄清发酵液中加入14%的蔗糖，待完全溶解后装入容器中，用压盖机封口。
杀菌、冷却：灌装后的发酵液在65 ℃下杀菌30 min，取出冷却至常温，即可得到黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料。
1.3.3 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料发酵工艺优化单因素试验
饮料于37 ℃、120 r/min下发酵，分别考察植物乳杆菌接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（V/V））、原料和水的比例（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL））、发酵时间（40 h、48 h、56 h、64 h、72 h）、装液量（30%、40%、50%、60%、70%），对还原糖利用率和感官评分的影响。
1.3.4 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料发酵工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果，选择固液比（A）、发酵时间（B）、装液量（C）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，采用Box-Bohnken试验设计3因素3水平试验，确定最佳工艺参数。Box-Bohnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design
1.3.5 测定方法
还原糖含量测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[13]（还原糖利用率=（发酵前原液中还原糖量-发酵后发酵液中还原糖量）/发酵前原液中还原糖量×100%）；可溶性固形物测定：采用折光计法[14]；总酸含量测定：采用酸碱滴定法[15]；γ-氨基丁酸含量测定：采用比色法[16]。
微生物指标测定：按照国标GB 4789.2—2016《食品微生物菌落总数的测定》、GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB 29921—2013《食品中致病菌限量》进行测定[17-19]。
1.3.6 感官评分方法
感官评定参照QB/T 5323—2018《植物酵素》中规定的评价标准[20]，满分10分。具体评分标准见表2。
表2 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of compound lactic acid bacteria beverage of Auricularia auricular and Nitraria tangutorum
1.3.7 数据处理
采用Origin、Design ExpertV8.0.6等软件对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 接种量的影响
图1 不同接种量对还原糖利用率和感官评分的影响
Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation
由图1可知，接种量＜2.0%之前，植物乳杆菌产少量的黏性物质，对产品的风味产生不利影响，且复合发酵液中乳酸发酵不彻底，导致乳酸转化率较低；接种量在2.0%时，还原糖利用率达到27.7%，其感官评分也最高，为7.0分；接种量在2.5%时，菌体之间竞争能力强，消耗营养也更多，用于生成乳酸的底物较少，不利于乳酸形成，还原糖利用率大幅下降；接种量在3.0%时，部分乳酸菌种在竞争中占据优势，使得还原糖的利用率再次上升，但发酵液中营养物质充分利用后产酸不再增加[21]。因此，植物乳杆菌最佳接种量为2.0%。
2.1.2 固液比的影响
图2 不同固液比对还原糖利用率和感官评分的影响
Fig.2 Effects of different solid-liquid ratio on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation
由图2可知，固液比在1∶6（g∶mL）与1∶7（g∶mL）时，加入到原料中的水量过少，导致原料在植物乳杆菌发酵时还原糖的浸出不完全，还原糖利用不足。发酵液较浓稠，流动性较差，口感欠佳；当固液比为1∶8（g∶mL）时，植物乳杆菌对还原糖的利用率及感官评分最高，分别为39.5%、7.2分。而固液比在1∶9（g∶mL）和1∶10（g∶mL）时，由于加入的水量过多，对原液的稀释倍数过大，最终的发酵液较稀，味道寡淡，风味欠缺。因此，最佳固液比为1∶8（g∶mL）。
2.1.3 发酵时间的影响
图3 不同发酵时间对还原糖利用率和感官评分的影响
Fig.3 Effects of different fermentation time on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation
发酵时间是影响发酵原液产品风味的关键所在。因为乳酸菌有产酸的作用，若时间过短，发酵原液中酸少醇多，口感欠佳；若发酵时间过长，发酵原液中酸多醇少，同样影响品质[26]。
由图3可知，当发酵时间＜64 h之前，还原糖利用率和感官评分呈现明显上升趋势。发酵至40 h，还原糖的利用率仅有8.2%，感官评分为5.7分；发酵48 h时，还原糖利用率上升至17.5%，感官评分为6.5分；发酵56 h时，还原糖利用率为35.0%，感官评分7.4分。当发酵至64 h时，还原糖的利用率达43.9%，感官评分最高，为8.0分；发酵时间＞64 h之后，还原糖利用率上升趋势平缓，发酵从64 h到72 h，还原糖利用率仅上升1.8%。因为物料中营养有限，发酵已接近尾声。但其感官评分下降至7.5分。因此，最适发酵时间为64 h。
2.1.4 装液量的影响
植物乳杆菌是异养厌氧型微生物，当瓶内氧气耗尽后开始无氧呼吸[22]。
图4 不同装液量对还原糖利用率和感官评分的影响
Fig.4 Effect of different liquid-loading volume on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation
由图4可知，装液量＜60%之前，还原糖利用率不断升高，感官评分也随之增加。装液量由40%升高到50%的过程中，其还原糖利用率变化最大，由31.5%迅速提高到50.01%。感官评分在此时间内也由6.4分提升到7.5分；装液量为60%时，还原糖利用率最高，达50.88%。同时产品感官评分也最高，为8.5分，此时酸度易被接受，口感清爽；装液量＞60%之后，还原糖利用率及感官评分均呈现下降趋势。因此，最适装液量为60%。
2.2 黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面模型的建立及显著性检验
采用Box-Bohnken中心组合试验设计，考察各因素对还原糖利用率和感官评分的影响，借助Design ExpertV8.0.6软件进行分析。根据单因素试验结果，固定接种量为2%（V/V），选取对还原糖利用率和感官评分影响较大的3个因素：固液比（A）、发酵时间（B）、装液量（C），以感官分数为（Y）为响应值，采用Box-Bohnken试验设计，试验方案及结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests
表4 回归方程显著性检验与方差分析
Table 4 Significance test and variance analysis of regression equation
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
通过Design ExpertV8.0.6软件对表3试验结果进行二次回归分析，获得固液比（A）、发酵时间（B）、装液量（C）对黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料感官评分（Y）的回归方程：
由表4可知，回归方程模型P值为0.000 1＜0.01，极显著；失拟项P值为0.473 3＞0.05，不显著；说明建立的回归方程拟合良好。决定系数R2=0.991 7，说明99.17%的响应值变化可以用该模型解释。该试验模型可用于确定黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料的最佳工艺。对感官评分影响次序依次为发酵时间＞固液比＞装液量，其中一次项B、二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A、C及交互AB相对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著。
2.2.2 因素交互作用响应面分析
固液比、发酵时间和装液量对白刺果复合乳酸菌饮料感官评分影响的响应面及等高线见图5。
图5 固液比、装液量及发酵时间对复合乳酸菌饮料感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid-liquid ratio,liquid-loading volume and fermentation time on sensory evaluation of compound lactic acid bacteria beverage
由图5可知，各因素在植物乳杆菌发酵过程的交互作用，AB交互作用差异显著，其表现为等高线形状为椭圆形。AC和BC交互作用不显著，等高线形状为圆形。发酵时间与固液比响应面曲线相对较陡，因此对感官的影响最显著；而发酵时间与装液量、固液比与装液量曲线较为平缓，响应值变化随其数值的变化较小，因此对感官评分影响较小。
2.2.3 验证试验
采用Design ExpertV8.0.6软件对回归模型进行分析，获得的最佳发酵工艺为：固液比1∶8（g∶mL），发酵时间63 h，装液量58%。在此优化条件下进行3次重复验证试验，得到产品的感官评分的实际值为9.1分，与理论预测值9.06分相近。综上，说明实验所得模型与实际情况拟合程度良好，能够较好地反映出固液比、发酵时间和装液量与复合发酵原液感官评分之间的关系，可采用该模型对产品的感官评分进行预测。
2.3 产品质量评价
2.3.1 感官指标
产品呈亮红褐色，酸甜适中，口感柔和细腻，拥有黑木耳白刺果的天然风味和乳酸发酵的特殊香气。
2.3.2 理化指标
在最优发酵条件下得到的黑木耳白刺果复合乳酸菌饮料还原糖含量为3.80 mg/mL，总酸度为2.48 g/100 mL，可溶性固形物含量为4.5%，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL。
2.3.3 微生物指标
细菌总数≤100 CFU/mL；大肠菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未检出。
3 结论
本研究以食用菌黑木耳为主要原料，搭配白刺果，采用植物乳杆菌发酵，研究了复合原液的发酵工艺。通过单因素试验和中心组合设计试验，采用响应面分析法优化了黑木耳白刺果复合发酵原液的工艺条件，确定最终的工艺参数为：木耳、白刺果质量比5∶1，固液比1∶8（g∶mL），植物乳杆菌发酵阶段接种量2.0%（V/V），于37 ℃下发酵时间63 h，装液量为58%。在此优化条件下，复合乳酸菌饮料感官评分为9.1分，还原糖含量为3.80mg/mL，酸度为2.48 g/100 mL，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL，颜色为红褐色，拥有纯正乳酸香气，酸度适宜，口感细腻。结果表明，在本试验范围内建立的二次回归模型准确有效，可提高复合发酵液的品质，为开发新型黑木耳白刺果复合发酵饮料提供了新的依据。
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