酱油主要以黄豆、小麦粉、食用盐为原材料，利用微生物和酶共同作用，经过复杂的生物化学变化，赋予食物特殊的香味和特有的色泽，最终形成具有香气醇厚、口感鲜美的液态调味品[1-2]。香气物质是酱油的灵魂[3]，关于酱油香气典型的描述有酱香、豉香、酯香，因酿造者的理解存在差异，这三类香气没有严格的定义。酱油中主要香气成分的组成取决于原料、生产工艺及参与发酵的微生物等因素，另外，温度、光照、压力及环境污染物等外界因素也会影响酱油香气成分组成[4-6]。酱油的香气很复杂，因此选择合适的前处理方法才能真实、准确的揭示香气成分[7]。固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）具有操作简单、无溶剂及可减少香气损失等特点，能够快速完成采样、萃取、富集和进样几个步骤，而同时蒸馏萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）是通过同时加热酱油与有机溶剂至沸腾来实现的，少量溶剂就可以提取大量样品，香气成分得到浓缩，对微量成分萃取率较高[8]。两种萃取方法均使用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪进行分析。GC-MS技术是一种广泛应用于对食品中挥发性风味物质进行定性和定量的风味评价方法[9]。刘非等[10]选用5种固相微萃取头分别萃取酱油挥发性成分，通过GC-MS分析，共鉴定出86种挥发性成分。冯云子[11]优化了SDE法的萃取条件，结果显示，有92.45%的物质相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）＜20%、50.94%的化合物RSD＜10%，表明该优化方法稳定，有良好的重现性。
本试验应用两种前处理方法对同一种酱油的香气进行提取，并对比其成分，以期为酱油香气的萃取提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱油：广州市售；二氯甲烷（分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；正戊烷（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；氯化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；无水硫酸钠（分析纯）：广州化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
6890-5973N GC-MS、毛细管色谱柱DB-WAX UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent科技有限公司；100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取头：美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 同时蒸馏萃取法
取100 mL酱油样品和100 mL 35%的食盐水置于500 mL圆底烧瓶中，加入沸石，连接同时蒸馏装置，用电热套加热至140 ℃左右，保持物料微沸；另将50 mL二氯甲烷加入100 mL圆底烧瓶中，55 ℃水浴，同时蒸馏萃取装置接入冷凝水。两侧溶液出现回流现象时，开始计时，萃取2 h，待装置冷却，收集溶剂部分，向萃取液中加入适量无水硫酸钠后立即密封好瓶口，冷藏2 h以上。取出后快速过滤，滤液置于50 mL茄形瓶中，40 ℃水浴旋转蒸发浓缩至1 mL，除去大部分二氯甲烷溶剂，然后过0.22 μm有机膜，进行GC-MS分析。
GC-MS条件：色谱柱为DB-WAX毛细管色谱柱（30.0m×250 μm×0.25 μm），载气为高纯度氦气（He）流速1.0 mL/min，不分流；电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，灯丝发射电流为0.25 mA，进样口温度230 ℃，检测器温度280 ℃，离子源温度220 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围为30～550 m/z，溶剂延迟3.8 min；起始柱温为40 ℃并保持4 min，以6 ℃/min的速度升温至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持10 min。
运用峰面积归一法[12]计算各挥发性风味物质含量。
1.3.2 固相微萃取法
取8 mL酱油与搅拌子加入20 mL顶空瓶中，放入恒温磁力搅拌器，在60 ℃条件下平衡10 min[13]，萃取头距样品液面0.5 cm左右，萃取45 min，在GC-MS进样口（230 ℃）解吸5 min。萃取头首次使用时，在规定温度条件下老化至无杂峰。
GC-MS条件：色谱柱等条件同方法1.3.1，检测器温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围为30～330 m/z；起始柱温为40 ℃并保持2 min，以8 ℃/min的速度升温到180 ℃，再以3 ℃/min的速度升温至220 ℃，保持8 min。
2 结果与分析
分别采用同时蒸馏萃取法与固相微萃取法对酱油中挥发性风味物质进行提取，结合GC-MS对其香气成分进行鉴定分析，总离子流色谱图见图1。由图1A、图1B可知，同时蒸馏萃取的主要挥发性成分较丰富。
图1 同时蒸馏萃取法（A）、固相微萃取法（B）提取酱油香气成分的总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components extracted from soy sauce by simultaneous distillation extraction (A) and solid-phase microextraction (B)
2.1 两种前处理法检测的各类香气物质的比较
表1 两种前处理法检测到的各类挥发性风味物质的百分比
Table 1 Percentage of various flavor substances detected by two pretreatment methods
由表1可知，两种方法检测出来的酸类物质相对含量占比最多，含硫类最少。SDE法处理检测到的呋喃类物质排第三占比18.16%，而SPME法处理检测到的呋喃类物质排第七占比2.55%，相对含量远远小于SDE法处理。SPME法检测到其他类，如嘧啶、吡咯与喔啉等物质占比18.98%，而SDE法测出的其他类占比5.38%；除了SPME法未检测出的碳氢类，两种方法检测到的各类物质的相对含量占比排序差别不大。
2.2 两种前处理方法检出的各香气物质的比较
由表2可知，SDE法检出的香气物质较丰富，有73种，SPME法检出61种。其中有20种物质是两种方法共同检出，总共检出114种物质。在种类数上，固相微法萃取的酯类与吡嗪类相对更加丰富，但在相对含量上，SDE法检测出的吡嗪与酯类远远高于SPME法检测的。
表2 SDE-GC-MS法与SPME-GC-MS法检测酱油中各类挥发性风味物质相对含量
Table 2 Relative contents of various volatile flavor substances of soy sauce detected by SDE-GC-MS and SPME-GC-MS
续表
续表
注：“-”表示未检出。
醇类化合物香气成分与酵母菌发酵作用存在主要的关系，醇类物质可经过化学反应后，转换为酯类物质，使人感受到浓郁香气[14]。SDE与SPME法分别检出9种醇，其中苯乙醇、2,3-丁二醇是两种方法共同检出，SDE法检出的主要为高级醇。
酱油的酸味是以乳酸、乙酸为主的有机酸类，它们不仅是呈味成分，而且关系到酱油的香气，也是形成酯类物质的重要成分[1]。两种方法共检测到的酸类物质有乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、山梨酸，SDE法主要检测出长链脂肪酸，SPME法主要检测出中链脂肪酸。
醛类物质主要来自氨基酸降解、微生物的转化作用和油脂的氧化降解，有些醛类物质本身不呈味，但在复杂的酱油酿造中可与其他成分生成酱油特有的香气成分，两种方法共同检出的苯乙醛具有类似风信子的香气，低浓度具有水果的甜香气。两种方法分别检出3种醛，共检出4种。
酯类物质主要通过酵母菌对大豆油脂作用产生醇类和酸类酯化反应得到[15]，它们具有果香并使酱油呈浓郁的酯香，而且能够掩盖其他化合物带有的不良香气[16]。SPME法检出的酯类相对SDE法多一些，分析可能是SDE法加热提取过程中容易造成损失。
呈香酚类物质主要是曲霉在发酵过程中通过降解作用生成的，主要贡献给酱油烟熏香和焦糖香味[17]。愈创木酚、4-乙基愈创木酚与4-乙基苯酚是酱油中重要的酚类物质。两种前处理方法均萃取出，SDE法检测出7种，SPME法检测出4种。
吡嗪是一类具有坚果香，焦香味的物质[18]，SDE法检测出6种，SPME法检测出7种。
呋喃类化合物及糠醛在微生物作用下会产生一定的化学反应，使反应物产生谷物香气及咖啡香气，杂环类化合物的挥发性交叉[14]，SDE法检测出8种呋喃类物质，而SPME法对呋喃类化合物吸附情况较差，检测出3种。
烯烃类只在SDE法检测出，其中β-蒎烯具有松节油香气、干燥木材和松脂气味。d-柠檬烯具有新鲜橙子及柠檬样香气。萜品烯具有柑橘和柠檬似香气。
含硫化合物虽然相对含量不高，但对整体风味有很大影响，它们来自含硫氨基酸、肽等的降解[19]，在两种方法中均检出的3-甲硫基丙醇低浓度时有强烈芬芳的肉或肉汤香气和滋味。
其他类物质在极大程度上也丰富了酱油的风味，包括吡咯、嘧啶、噻唑等，SDE法检测出7种。SPME法检测出6种。其中2-乙酰吡咯具有坚果味、带些微香豆素的香气[20]，是两种方法共同检测到的物质。
3 结论
两种前处理方法检出的各类物质的含量相对能反应酱油中各类物质的占比情况，结果显示，两种方法检出的酸类相对含量最高，含硫化合物最低。但两种方法检出的呋喃类与其他类（含氮类化合物）的差异较大，其中SDE法利于呋喃类的萃取，而SPME法对呋喃类的吸附较少，但是SPME法萃取出的其他类化合物相对较多。对比两种前处理方法，SDE可以将香气物质较大程度的萃取出来，但其萃取时间长，且高温蒸馏过程可能造成易挥发性物质有所损失且容易产生样品中非原有的物质，受热后的香气轮廓与其原样品的香气轮廓相比有差异。SPME法萃取时间短，且易吸附样品中的半挥发性、挥发性成分，整个提取过程保持在60 ℃左右的条件下进行，无高温影响，比较能真实地体现样品的香气成分。但对低挥发性物质的萃取效率较低。两种前处理方法各有优点，但同时存在着缺点，为了更全面地检测酱油中的香气成分，还应当结合多种萃取及检测方法。
[1]包启安.酱油科学与酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2011.
[2]王夫杰，鲁绯.我国酱油研究现状与发展趋势[J].中国酿造，2010，29（1）：3-7.
[3]高献礼.高盐稀态酱油在发酵和巴氏杀菌过程中风味物质形成和变化的研究[D].广州：华南理工大学，2010.
[4]张海珍.酿造酱油发酵过程风味变化规律及工艺优化的研究[D].杭州：浙江工商大学，2010.
[5]FENG Y,CAI Y,SU G,et al.Evaluation of aroma differences between high-salt liquid-state fermentation and low-salt solid-state fermentation soy sauces from China[J].Food Chem,2014,145:126-134.
[6]PUJCHAKARN T,SUWONSICHON S,SUWONSICHON T.Development of a sensory lexicon for a specific subcategory of soy sauce:Seasoning soy sauce[J].J Sens Stud,2016,31(6):443-452.
[7]刘翔，邓冲，侯杰，等.酱油香气成分分析研究进展[J].中国酿造，2019，38（6）：1-6.
[8]周志，徐永霞，胡昊，等.顶空固相微萃取和同时蒸馏萃取应用于GC-MS分析野生刺梨汁挥发性成分的比较研究[J].食品科学，2011，32（16）：286-289.
[9]LEHOTAY S J,SAPOZHNIKOVA Y,MOL H.Current issues involving screening and identification of chemical contaminants in foods by mass spectrometry[J].Trac Trend Anal Chem,2015,69(6):62-75.
[10]刘非，杜丽平，肖冬光.酱油挥发性成分固相微萃取条件的优化[J].食品与发酵工业，2017，43（7）：70-75.
[11]冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].广州：华南理工大学，2015.
[12]CHEN Z Y,FENG Y Z,CUI C,et al.Effects of koji-making with mixed strains on physicochemical and sensory properties of Chinese-type soy sauce[J].J Sci Food Agr,2015,95(10):2145-2154.
[13]刘非.基于GC-MS 的酱油风味物质分析[D].天津：天津科技大学，2017.
[14]曾小波，李理，朱新贵.两株米曲霉菌种的发酵性能研究[J].中国酿造，2016，35（8）：17-21.
[15]ZHANG Y F,TAO W Y.Flavor and taste compounds analysis in Chinese solid fermented soy sauce[J].Afr J Biotechnol,2009,8(4):673-681.
[16]朱新贵，李学伟，曾小波.典型广式酱油与日式酱油的风味物质差异研究[J].中国酿造，2016，35（7）：30-35.
[17]GIRI A,OSAKO K,OKAMOTO A,et al.Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fish paste in comparison with fish sauce,fermented soy paste and sauce products[J].Food Res Int,2010,43(4):1027-1040.
[18]童佳.米曲霉发酵高盐稀态酱油过程中挥发性风味物质及蛋白酶表达规律研究[D].无锡：江南大学，2017.
[19]SUN S Y,JIANG W G,ZHAO Y P.Profile of volatile compounds in 12 Chinese soy sauces produced by a high-salt-diluted state fermentation[J].J I Brewing,2010,116(3):316-328.
[20]SHAHIDI F.肉制品与水产品的风味[M].李杰，朱国斌译.北京：中国轻工出版社，2001：8.