大曲又称块曲或砖曲，以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物在上面生长而制成[1]。大曲是酒之骨，是有益微生物和有效生物酶、香味物质和香味物质前驱物质的载体，它决定了中国白酒的香型、风格和流派[2]。大曲富含糖类物质，主要包括淀粉、糊精、低聚糖、二糖、单糖等[1]，目前大曲中糖的研究主要是还原糖和总糖[3]，而具体到单一种类糖的研究鲜有报道，WU X等[4]运用1H核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术检测了大曲中的葡萄糖、麦芽糖和甘露糖醇等甜味物质，石亚林等[5]运用衍生化方法定性并定量了大曲中游离态的6种糖和6种糖醇，研究了不同白酒大曲中6种糖和6种糖醇的变化规律。大曲中糖类组成的系统性研究，可在一定程度上为大曲中微生物代谢机制的研究提供新的思路和理论依据。
目前单、双糖的检测方法有化学法[6]、高效液相色谱法[7-9]、离子色谱法[10-12]和质谱法[13-20]。化学法测定糖类物质，检出限较高，且无法同时测定多种糖类物质；高效液相色谱法多采用示差折光检测器或蒸发光检测器等通用型检测器，存在样品分析时间较长或重现性不理想等问题；离子色谱法对糖类物质分离较好，但受样品基质干扰严重；质谱法具有选择性好，检出限较低，抗干扰能力强等特点，是糖类物质检测方法发展趋势。大曲属于复杂的发酵制品，容易产生难以解析的背景基质的干扰，导致测定的不准确性，本研究基于简便的样品制备和超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）检测技术，以期建立一种能同时快速、准确测定大曲中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖醇的直接分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大曲：某酒厂提供；乙腈（质谱纯）：德国默克公司；乙酸铵（质谱纯）、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖醇标准品：美国Sigma公司；所有实验用水均为超纯水（18.2 MΩ）。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）：美国Thermo Fisher Scientific；IQ7003纯水仪：美国MILLIPORE公司；MIKRO 220R离心机：德国Hettich公司；XP205分析天平：瑞士METTLERTOLEDO公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
准确称取2.00 g样品于50 mL离心管中，加入30 mL水，2 000 r/min振荡提取15 min，10 000 r/min、4 ℃离心5 min后取上清液0.75 mL于2 mL离心管中，加入0.75 mL乙腈后漩涡混匀5 min，10 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，取上清液用乙腈稀释2倍，漩涡混匀后再次高速冷冻离心10 min，取上清液用体积分数75%的乙腈水溶液稀释10倍，过0.22 μm微孔滤膜后进样分析。此时样品中目标物对于原样品已稀释600倍。
1.3.2 色谱条件
色谱柱：ACQUI TY BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱温：50 ℃；流动相：A为含有0.1%氨水的乙腈，B为含有0.1%氨水的5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液；流速：0.25 mL/min；进样体积1.0 μL；线性梯度洗脱，起始流动相为90%的A，10%的B，保持5 min，到12 min流动相A变为75%，流动相B变为25%，到17 min流动相A变为60%，流动相B变为40%，保持6 min，到24 min变成起始流动相比例，保持6 min，整个分析流程30 min。
1.3.3 质谱条件
质谱条件：离子源采用加热电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）；吹扫气：35 arb；鞘气：10 arb；反吹气：0 arb；电离电压：-3.0 kV；离子传输管温度：320 ℃；离子源温度：200 ℃；负离子模式监测，采用full MS-Target MS2扫描方式测定，扫描范围50～370 m/z，full MS扫描的分辨率为70 000，Target MS2扫描模式分辨率为17500。
1.3.4 标准溶液配制
葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖醇分别准确称取0.100 g至100.0 mL容量瓶中，用体积分数75%的乙腈水溶液溶解并定容至100.0 mL，得到质量浓度为1.0 g/L的标准储备液。
分别精密量取上述6种标准储备溶液适量，置于10.0 mL容量瓶中，加体积分数75%的乙腈水溶液定容，配制成质量浓度为0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L、50.00 mg/L的混合标准品工作液。
2 结果与分析
2.1 液相色谱条件的优化
5种糖类物质，葡萄糖和果糖，蔗糖、麦芽糖和乳糖分别是同分异构的单糖和双糖，分子质量完全一样，结构相似，它们的二级特征碎片也有极高的相似度，因此用质谱分别检测5种糖含量的前提是实现它们在液相部分的完全分离[21]。乙腈-乙酸铵流动相体系能较好的将5种糖类物质洗脱分离，但峰型较差，在乙腈-乙酸铵流动相溶液中添加0.1%的氨水，峰型有所改善，且甘露糖醇峰形较好，因此本方法中选择乙腈-乙酸铵流动相溶液中添加0.1%的氨水的流动相体系。同时研究发现流动相中乙腈起始含量＜75%，果糖与葡萄糖无法分离，而乙腈起始含量＞95%，麦芽糖和乳糖无法分离；不同的流速对5种糖的分离影响结果显示，流速＜0.25 mL/min，各化合物峰型较差，流速＞0.25 mL/min时，5种糖的分离效果较差；不同的柱温对5种糖的分离效果影响显示，柱温低于50 ℃，麦芽糖峰宽变大，峰型较差，且与乳糖分离效果较差，柱温高于50 ℃，麦芽糖与乳糖的峰型和分离效果较好。同时在样品的前处理中发现，只有当溶剂为体积分数75%的乙腈水溶液时，葡萄糖与果糖、蔗糖、麦芽糖与乳糖才可以较好的分离。
2.2 质谱条件的优化
利用流动注射的方式对6种化合物进样分析，优化离子源电压、温度、鞘气、辅助气、吹扫气、脱溶剂温度等参数，得到6种化合物的母离子均为分子离子峰[M-H]-，各物质的特征离子、碰撞能量见表1。6种化合物配制成混合标准工作液，进入仪器进行分析，6种化合物的质谱图见图1。
表1 6种化合物离子对及碰撞能量
Table 1 Ion pairs and collision energy of six kinds of compounds
注：“-”表示负离子模式。
图1 6种化合物质谱图
Fig.1 Mass spectrum of six kinds of compounds
2.3 样品前处理的优化
2.3.1 提取方式
糖及糖醇较易溶于水，因此本研究以水为提取溶剂。在提取方式上，常见的提取方法有静提法、振荡提取法、超声辅助提取法，静提法一般耗时较长，因此本文优先选择振荡提取法和超声辅助提取法。准确称取2.00 g样品于50 mL离心管中，加入30 mL水，对比振荡提取、超声辅助振荡提取两种提取方式，结果见图2。以化合物的峰面积为参照指标，由图2可知，两种提取方式对葡萄糖、麦芽糖、甘露糖醇的含量测定上无明显差异，选择更为环保的振荡提取；同时可以得出，在提取时间＞15 min后，各化合物的峰面积趋于稳定，所以选择提取时间为15 min。最终大曲样品的提取方式为振荡提取15 min。
图2 不同提取方式对化合物影响
Fig.2 Effect of different extraction methods on compounds
2.3.2 去除蛋白质和色素等干扰物
大曲主要原料为小麦，经过高温发酵后，大曲中含有大量的蛋白质类物质、美拉德反应产物及微生物代谢产物，用水提取后，提取液中含有大量的色素等物质。本研究考察了乙腈对沉淀蛋白和色素的效果，结果发现经过2次乙腈溶液稀释后高速冷冻离心处理，提取液可达到澄清透明状态，干扰物含量显著下降，达到大批量连续分析对样品洁净度的要求，此时样品的回收率高，且峰形较好，较少内源性杂质干扰。
2.4 标准曲线及方法检出限
将混合标准品储备液用体积分数75%乙腈水溶液配制成质量浓度范围为0.10～50.00 mg/L系列的混合标准工作液，分别在Q-Exactive仪器上进行测定，以峰面积为Y，质量浓度为X，得到线性回归方程；根据方法检出限为基线噪音10倍的方法测定方法检出限，结果见表2。
表2 6种化合物的线性方程、相关系数和检出限
Table 2 Linear equations,correlation coefficients and detection limits of 6 compounds
2.5 方法精密度和回收率
在上述实验条件下，将3个不同添加水平的大曲样品重复测定6次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。
表3 6种化合物的加标回收率试验结果
Table 3 Results of standard recovery rates tests of six kinds of compounds
由表3可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖醇的平均回收率分别为91.5%～102.3%、82.3%～93.3%、87.8%～94.1%、94.7%～108.4%、88.5%～102.4%、84.6%～98.3%，RSD分别为4.1%～5.6%、4.8%～6.2%、5.7%～8.4%、6.1%～9.4%、3.4%～5.4%、3.5%～4.2%，表明该方法精密度较好。
2.6 大曲样品的测定
选取某白酒生产企业的不同季节的大曲样品10份（A-J），按照1.3节方法制备样品待测液，上机检测，每种样品取3份平行测试，样品中5种糖和甘露糖醇的含量见表4。
表4 大曲中5种糖和甘露糖醇的含量
Table 4 Contents of five sugars and mannitol in Daqu mg/kg
注：“ND”表示未检出。
由表4可知，大曲中主要的还原糖和糖醇是葡萄糖和甘露糖醇，其中葡萄糖占还原性单糖绝大部分，麦芽糖占还原性双糖的绝大部分，果糖、乳糖和蔗糖含量相对较少，甘露糖醇的含量较为丰富。
3 结论
本研究建立了高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时检测大曲中多种糖和糖醇含量的方法。样品经过振荡提取，乙腈除去干扰物，高速冷冻离心等方式处理，采用ACQUI TY BEH Amide色谱柱，在负离子检测模式下进入高分辨质谱进行分析。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖醇在相应的质量浓度范围内，线性关系良好，R2均＞0.99，回收率在82.3%～102.4%之间，RSD在3.4%～9.4%之间，检出限在0.01～0.07 mg/L之间。
该方法系首次运用高分辨质谱检测大曲中的糖和糖醇，具有专属性强、前处理简单、准确可靠、灵敏度高、重复性好等优点。同时运用该技术对酱香型高温大曲中糖类物质进行测定，发现大曲中葡萄糖和甘露糖醇含量最高，果糖和麦芽糖次之，乳糖和蔗糖含量较低，且只有在部分大曲中含有，可进一步对大曲发酵过程中糖及糖醇类物质的变化进行系统性分析，可在一定程度上为大曲中微生物代谢机制的研究提供新的思路和理论依据。
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